金银花露不同蒸馏段挥发性成分的测定分析

(北京一轻研究院,北京市食品工业研究所,北京 101111)

金银花(LonicerajaponicaThunb.),正名忍冬,是忍冬科忍冬属植物,其干燥花蕾或带初开的花是一种药食同源的天然产物,被列于国家卫生健康委员会发布的《按照传统既是食品又是中药材物质目录》中。金银花有清热解毒、疏散风热的功效,可用浸提法来制备茶饮料[1]、泡腾饮料片[2],也可用蒸馏法来制备金银花露[3],自古以来就是夏天消暑清热的饮品,据《纲目拾遗》记载:“气芬郁而味甘”。金银花露除了作为非处方中药制剂在药店销售外,也常被制成无糖型或含糖型的普通饮料在超市销售,生产厂家主要集中在湖北省、山东省。

金银花露的已有研究工作主要有:张幸生等[4]研究了防腐剂、pH、抗氧化剂等对金银花露质量稳定性的影响;杜春华等[5]建立了金银花露微生物限度与控制菌的检查方法并进行了验证;张瑾等[6]、陆兴毅等[7]分别建立了液相色谱测定金银花露中防腐剂的方法;张思远等[8]研究发现金银花露残液提取物对金黄色葡萄球菌等致病菌的生长有明显的抑制作用;肖瑛琼等[9]利用金银花露的生产固体残渣,通过添加氧化钙制备了生物有机肥。徐俊虎等[10]将厌氧污泥接种至金银花露药渣,发酵获得了甲烷。上述工作一部分集中于金银花露的质量控制(性状、微生物、防腐剂)研究;一部分集中于金银花露生产废渣的增值利用工艺开发。目前,与金银花制品相关的挥发性成分研究主要集中于金银花挥发油的分析[11-16],针对金银花露挥发性成分的相关研究还很少[17-18],仅有少数研究者采用气相色谱法测定了金银花露中芳樟醇的含量,未涉及到金银花露挥发性成分的种类、含量及其香气特点分析。因此,本文采用顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用技术(Headspace-Solid phase microextraction-Gas chromatography-Mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)[19-22],对金银花露不同蒸馏段挥发性成分的种类、含量进行了测定分析,并结合香气分析、聚类分析,旨在为金银花露实际生产中的蒸馏时间控制、饮品风味设计提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

金银花干燥花蕾 亳州市大西北药业有限责任公司;C7～C30饱和正构烷烃标准品 色谱纯,美国Supelco公司;环己酮 纯度>99.0%,TCI公司。

7890A-5975C气相色谱质谱联用仪 美国Agilent公司;手动进样器及萃取头(50/30 μm DVB/CAR/PDMS) 美国Supelco公司;DC-NSG-20多功能提取浓缩机组 上海达程实验设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备 称取干燥的金银花625 g分装于5个纱布袋,加20 L反渗透纯化水,在多功能提取浓缩机组中减压蒸馏(-0.09 MPa),观察蒸馏液收集罐的液位,液位升至2 L刻度时排空第1段蒸馏液存于样品瓶,继续收集蒸馏液,待液位升至2 L刻度时又排空储存,直至收集第7段蒸馏液后,结束蒸馏。每份样品取三个平行,测定结果取均值。

1.2.2 HS-SPME处理条件 取5 g金银花蒸馏液样品,置于15 mL固相微萃取专用样品瓶中,加入内标物环己酮,密封,并将样品瓶放入50 ℃水浴中平衡15 min,之后将萃取头(50/30 μm DVB/CAR/PDMS)插入样品瓶中,继续于50 ℃水浴中顶空萃取40 min,萃取结束后进样,240 ℃解吸5 min。

1.2.3 GC-MS检测条件 气相色谱条件:DB-WAX石英毛细柱(30 m×250 μm,0.25 μm)色谱柱;进样口温度:240 ℃;升温程序:40 ℃保持3 min,以5 ℃/min升至120 ℃,保持4 min,10 ℃/min升温至200 ℃,保持4 min,20 ℃/min升至240 ℃,保持8 min;载气氦气(He)，流速1.0 mL/min,不分流。质谱条件:电子电离(Electron ionization,EI)源;电子能量70 eV;传输线温度240 ℃;离子源温度230 ℃;四级杆温度150 ℃;质量扫描范围20.00～500.00 m/z。

1.2.4 定性和定量分析 定性分析:利用安捷伦质谱数据处理系统结合NIST 11标准质谱库对各化合物进行检索,并通过C7～C30饱和正构烷烃作为对照标准计算保留指数,对照相关文献报道,综合定性。定量分析:采用内标法半定量,各样品中挥发性化合物含量的计算公式如下:

挥发性化合物含量(μg/g)=(组分峰面积×内标物质量)/(内标物峰面积×样品质量)

1.2.5 蒸出比例计算 以全部七个蒸馏段的挥发性成分含量总和为基数,计算不同蒸馏段挥发性成分的本段蒸出比例和累计蒸出比例,具体计算公式如下:

式中,i=1～7代表蒸馏段数,C代表各段蒸馏液挥发性成分的浓度,V代表各段蒸馏液的体积。

1.2.6 主体香气分析 将某种挥发性化合物的浓度除以其阈值,便可以得到一个评价该化合物对整体香气贡献的量值,即气味活性值(Odor activity value,OAV),具体计算公式如下:

式中,c代表挥发性化合物的浓度,cT代表该化合物在水中的阈值。一般来讲,只有当某种化合物的浓度大于其阈值,即OAV>1,才被认为是主体香气成分,0.1

1.3 数据处理

采用Excel 2016和Origin 2017处理实验数据并绘图,采用SPSS 19.0对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 金银花露不同蒸馏段挥发性成分的GC-MS测定结果

图1是金银花露七个蒸馏段的总离子流色谱图,可以看出挥发性成分出峰时间主要集中在15～20、25～30 min两个时间段。通过检索NIST 11标准质谱库,并与文献报道的保留指数对比,在金银花露七个蒸馏段中共鉴定出62种化合物,主要是醇、醛、萜、酮、酯类等物质,采用内标法半定量计算出不同蒸馏段中各化合物的含量,结果如表1所示。其中数量较多的是醇类和醛类:鉴定出醇类化合物18种,其中饱和醇13种、不饱和醇5种,它们中含量较高的有2-庚醇、正己醇、叶醇、1-辛烯-3-醇、正辛醇、(Z)-3-壬烯-1-醇;鉴定出醛类化合物17种,其中不饱和醛11种,饱和醛6种,它们中含量较高的有(E)-2-丁烯醛、(E)-2-己烯醛、(E,E)-2,4-庚二烯醛、苯甲醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛。其次,鉴定出酯类化合物12种,包括正己酸甲酯、正己酸乙酯、乙酸正已酯等,但含量都不高。再次,鉴定出萜类8种、酮类7种,香叶醇、香茅醇、芳樟醇是含量较高的萜类化合物,β-紫罗兰酮、(E,E)-3,5-辛二烯-2-酮、香叶基丙酮是含量较高的酮类化合物。

表1 不同蒸馏段金银花露中的挥发性成分及含量Table 1 Volatile components and contents in different distillation fractions of honeysuckle flower

续表

注:“-”表示未检出。

图1 不同蒸馏段金银花露中挥发性成分的总离子流色谱图Fig.1 Total ion chromatograms of volatile components in different distillation fractions of honeysuckle flower

2.2 金银花露不同蒸馏段挥发性成分的比较

醇、醛、萜、酮、酯类在金银花露不同蒸馏段中的含量如图2所示,可以看出各蒸馏段中醇类、醛类的含量均较高。由图2还可知,随着蒸馏进行(即蒸馏段从第1～7段),金银花露中所有挥发性化合物的总含量在不断降低,由214.49 μg/g逐渐下降到12.21 μg/g,其中第1～2段、第2～3段、第3～4段的降幅较大,分别为75.95%、46.29%、33.70%;第4～5段、第5～6段、第6～7段的降幅较小,分别为13.12%、5.94%、18.67%。这说明在蒸馏前期大部分挥发性成分已被蒸出,到蒸馏后期挥发性成分趋于少量而稳定地蒸出。

表2 不同蒸馏段对应的本段蒸出比例和累计蒸出比例Table 2 Current and cumulative evaporation ratio corresponding to different distillation fractions

图2 不同蒸馏段金银花露中各类挥发性成分的含量Fig.2 Content of volatile components in different distillation fractions of honeysuckle flower

金银花露挥发性成分在不同蒸馏段对应的本段蒸出比例和累计蒸出比例见表2。由表2可知,第1段蒸出的挥发性成分含量已占所有七个蒸馏段挥发性成分含量总和的60.37%,至第3段时累计蒸出比例则已达82.68%,再往后每增加一个蒸馏段,提升比例只有3%～6%。这意味着以挥发性物质含量为考核指标的话,后几个蒸馏段的能耗较高。因此,在实际生产中,可根据金银花用量、蒸出挥发性物质含量、能源成本等因素来综合考虑最优蒸馏时间。

除了含量不同,不同蒸馏段中各类挥发性成分的比例也有所不同,具体如图3所示。由图3可知,在金银花露所有蒸馏段中,醇类和醛类都是占比较高的两类化合物,它们含量之和占所有挥发性化合物总含量之和的比例为70%左右。随着蒸馏进行,不同蒸馏段中各类化合物的所占比例也在不断变化,其中变化明显的是醇类和醛类化合物。醇类化合物由第1段占比38.78%逐渐下降并稳定在25%左右,而醛类化合物由第1段占比32.60%逐渐上升并稳定在45%左右,说明醇类较醛类更易蒸出,因为羟基较醛基亲水性更强。萜类和酮类由第1段占比11.94%和11.05%缓慢降低至第7段占比8.52%和7.46%,酯类则由第1段占比5.63%缓慢升高至第7段占比13.37%。

图4 不同蒸馏段金银花露的气味活性轮廓Fig.4 OAV profile of different distillation fractions of honeysuckle flower

图3 不同蒸馏段金银花露中各类挥发性成分所占百分比Fig.3 Percentage of volatile components in different distillation fractions of honeysuckle flower

2.3 金银花露不同蒸馏段的香气分析

不同蒸馏段金银花露的香气强度与风格有所不同,这与它们所含挥发性化合物的OAV值有关。一般而言,OAV值越大,该化合物对整体香气贡献的程度越大。通过查阅文献[25],共查得40种挥发性成分在水中的阈值,结合表1种这些成分在不同蒸馏段的含量,便可计算出它们的OAV值,并得到金银花露不同蒸馏段的大致气味活性轮廓图,如图4所示(根据第1段化合物OAV值从大到小,在Y轴从上到下排列化合物名称)。

整体来看,β-紫罗兰酮、(E,E)-2,4-壬二烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、(E)-2-壬烯醛在所有蒸馏段中的OAV值都大于100,说明这4种成分对金银花露整体香气有明显的影响。β-紫罗兰酮呈甜的花香、木香气味,香气柔和淳厚[26],常用于配制如紫罗兰、桂花、兰花等花香型香精。(E,E)-2,4-壬二烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛都有一定的油脂香气,前者还带有花果香[27]。(E)-2-壬烯醛有类似纸板的气味,常在老化后的啤酒中测出[28]。

其次,1-辛烯-3-醇、香叶醇、香茅醇、芳樟醇、(E)-2-己烯醛、香叶基丙酮、正己醛、苯乙醛、正辛醇基本在所有蒸馏段中的OAV值都大于10,说明这9种成分对金银花露整体香气也有很显著的影响。1-辛烯-3-醇,也叫蘑菇醇,有一定的蘑菇和泥土气味[26]。香叶醇主要呈甜的玫瑰花香气[29-30]。香茅醇有类似新鲜玫瑰的特殊香气[31]。芳樟醇是全世界用量靠前的香料之一,具有甜的花香、木香气息,香气柔和[26,31]。(E)-2-己烯醛,也叫叶醛,呈新鲜的青草香气[31-32]。香叶基丙酮主要呈新鲜花香香气,带有一点甜的玫瑰花香气[30-31]。正己醛呈青草香、油脂香[26,31]。苯乙醛具有浓厚的花香[26,31]。正辛醇带有柑橘样气息,还有甜脂香味[33]。

再次,叶醇、(E)-柠檬醛、乙酸苯乙酯、正己酸乙酯、正壬醇、正癸醛、正壬醛、(E)-2-丁烯醛、正庚醛、甲基庚烯酮基本在所有蒸馏段中的OAV值都大于1,说明这10种成分对金银花露整体香气也会有一定的影响。叶醇呈新鲜草香、青香[26,31]。(E)-柠檬醛、正壬醇、正癸醛、正壬醛、正庚醛、甲基庚烯酮都具有一定的类似柠檬香、柑橘香的气味,前四者还带有油脂气味[26,31,33]。乙酸苯乙酯呈甜的玫瑰花香气息,还带有类似桃子的果香[26]。正己酸乙酯具有新鲜的甜香和水果香气味[26,33]。(E)-2-丁烯醛有特殊刺激性气味[34]。

综上,花香、青草香、油脂香、果香是金银花露的主体香气,(E)-2-壬烯醛、1-辛烯-3-醇、(E)-2-丁烯醛等化合物对其气味进一步构成特殊影响,最后共同构成了金银花露的独特气味。

由图4还可以看出,第1段的气味轮廓与其他蒸馏段明显不同,具体而言,第1段中OAV>1的化合物有34种,而其他段中OAV>1的化合物在21～25种之间。其他蒸馏段之间对比则既有类似又有不同,如第4～7段的轮廓较为相似,第2、3段与它们有所不同。

图5 不同蒸馏段金银花露气味活性值的聚类分析Fig.5 Clustering analysis of different distillation fractions of honeysuckle flower based on OAVs

为了更清晰、更客观地区分不同蒸馏段气味轮廓的区别,以平方欧氏距离为度量准则,采用组内连接距离方法进行系统聚类分析,结果如图5所示。由图5可知,金银花露第4、5、6、7蒸馏段在距离1.0可以聚为一类,结合图4来看,它们的OAV轮廓也极度相似,仅有细微差别,这也进一步说明了在蒸馏后期香气化合物趋于稳定蒸出。第3蒸馏段单独为一类,与第4～7蒸馏段稍有区别(相距1.0),结合图4来看区别主要源自1-辛烯-3-醇、香叶醇、(E)-2-己烯醛的OAV差别。第2蒸馏段单独为一类,与第3蒸馏段又稍有区别(相距1.0),结合图4来看区别主要源自苯乙醛、叶醛、(E)-柠檬醛、正癸醛、正壬醛的OAV差别。此外,第2、3蒸馏段中的1-辛烯-3-醇、(E)-2-己烯醛气味活性较高,使得这两个蒸馏段有一定的青草、泥土气息。第1蒸馏段则与其他所有蒸馏段区别明显,单独为一类,结合图4来看,该区别源自于第1蒸馏段中香茅醇、芳樟醇、香叶基丙酮、正己醛、正辛醇、乙酸苯乙酯、正己酸乙酯、正壬醇等化合物的OAV值较其他段蒸馏液均高出了一个量级,使得第1段蒸馏液的花香、果香风格尤为突出。综上,在实际生产中,可分段或合并相似段来获取不同呈香风格的蒸馏液。

3 结论

采用顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用技术,内标法半定量分析了金银花露七个不同蒸馏段挥发性成分的差异。不同于金银花挥发油主要成分为烃类、酯类、酸类[11-16],金银花露所含挥发性成分种类主要是醇类、醛类、萜类、酮类、酯类这五种物质。金银花露第1蒸馏段挥发性成分的含量(214.49 μg/g)远高于其他蒸馏段(51.58～12.21 μg/g),说明金银花中的大部分挥发性成分能较快地被蒸发出来。气味活性值分析表明花香、青草香、油脂香、果香是金银花露的主体香气,主要由β-紫罗兰酮、(E,E)-2,4-壬二烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、(E)-2-壬烯醛、1-辛烯-3-醇、香叶醇、香茅醇、芳樟醇、(E)-2-己烯醛、香叶基丙酮、正己醛、苯乙醛、正辛醇贡献(OAV>10)。不同蒸馏段的气味活性轮廓有所不同,第1段与其它段区别最为明显,其花香、果香风格尤为突出。综上,本课题的研究在促进金银花露节能生产、建立质量控制标准、设计饮品风味等方面有一定的参考价值,生产厂家可根据金银花露不同蒸馏段挥发性成分含量、比例、气味活性轮廓的差异,并结合原料成本、能源成本等因素来确定最优蒸馏工艺。