浓香型白酒中己酸检测方法研究

季 方，张士阳，吴建峰，左文霞，孙 莹，唐群勇，桂 翔

（江苏今世缘酒业股份有限公司，江苏 涟水 223411）

2015年8月25日，全国白酒标准化技术委员会浓香型白酒分技术委员会在成都完成了对《浓香型白酒》国家标准送审稿的审定工作。在此次标准修订工作中，最引人注目的一项变动就是将己酸和己酸乙酯的含量进行合并计算代替原标准中的己酸乙酯含量。在浓香型白酒中，酸类和酯类物质是白酒风味物质的重要骨架部分，其中己酸乙酯更是浓香型白酒的主体香味物质[1]，也是衡量、验证浓香型白酒质量优劣的关键理化指标。随着我国白酒消费逐步走向多样化，酒类正朝着中低度、营养、优质方向发展，在中低度白酒生命周期中，己酸乙酯水解现象成为了一个普遍存在的技术问题[2]。己酸乙酯水解与己酸酯化反应同时存在于酒体之中，二者相互转化方向受各种因素的影响不断移动直至达到动态平衡。在中低度酒中，由于乙醇含量较低的缘故使己酸乙酯水解反应更容易发生。随着货架期储存时间的延长和储存条件的变化，老酒体中己酸乙酯含量较新酒体会不可避免地下降，己酸含量则会上升[3]。如按照旧标中的规定，老酒中己酸乙酯含量就有可能低于标准规定以下，从而被判定不合格。针对这一问题，新标准以“己酸＋己酸乙酯”代替了“己酸乙酯”，用浓度之和的理化指标要求规避了二者浓度尤其是己酸乙酯浓度不稳定的现象，从而在一定程度上保障了老酒的“合法权益”。

除了己酸，白酒中还含有其他多种有机酸，这些酸类物质不仅能赋予白酒丰满和酸刺激感，而且还是很多酯类物质的重要前体物质。目前行业中关于白酒的风味物质成分有大量的研究[4-9]，众多的前处理方法和仪器分析技术被用来分析白酒中的风味成分[10-18]。随着《浓香型白酒》国家标准的修订工作逐步推进，建立一种准确、高效分析白酒中己酸含量的方法便成为了一项重要任务。

气相色谱（gas chromatography，GC）是现阶段白酒微量分析中最常用的技术。作为一种封闭系统色谱，其受外界影响较小，分离性能高、分析速度快、灵敏度也很高。气相色谱直接进样法是一种酒样不经处理或简单处理后就直接进入气相色谱分析方法，避免了样品处理过程中物质损失，具有良好的重现性和检测准确性。基于气相色谱的氢火焰检测器（flame ionization detector，FID）分析方法是目前最常见的白酒中微量成分定量方法，能够对包括己酸在内的众多成分进行准确分析。并且气相色谱直接进样法可以同时测定己酸、己酸乙酯等，尤其适合企业和检测机构作为白酒质量常规检测方法。但是相对于醇类、酯类组分，己酸的极性较强，沸点较高，因此对色谱系统，如色谱柱、衬管等有比较高的要求，需要采用特殊改良的聚乙二醇色谱柱来防止普己酸峰拖尾。高负荷的色谱柱同样会使己酸峰逐渐拖尾，影响测定的准确度。刘莎等[19]建立了气相色谱-FID检测器分析白酒中22种风味物质的分析方法。在选定的色谱条件下，采用Agilent 19091N-213安捷伦色谱柱，己酸工作曲线相关系数≥0.999，平均加标回收率为108.1%，精密度试验结果相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为2.9%。检出限达到了0.5 mg/mL。吴丽华等[20]利用LZP-930型白酒毛细管色谱柱，采用气相色谱法对白酒中29种微量成分进行色谱分离条件优化，建立了白酒中微量成分毛细管气相色谱分析方法。在选定的色谱条件下，己酸加标回收率达到了99.0%。胡国英等[21]建立一种毛细管气相色谱法测定白酒中有机酸类组分含量的方法。选择DB-WAX（30 m×0.32 mm×0.25 μm）毛细管气相色谱柱，通过优化气相色谱分离条件，采用内标标准曲线法进行定量。结果表明各有机酸类物质相关系数均＞0.999，己酸为0.999 59，回收率88.0%～98.0%，精密度试验结果RSD为1.83%。

现行白酒中的己酸检测受色谱柱或仪器性能等方面的影响，如完全按照《浓香型白酒》报批稿中的条件进行检测，检测结果误差较大。本研究将结合实际工作和实验条件，将对己酸检验方法进行优化改进。采用毛细管气相色谱分析联合内标法，通过对升温方式和速率、进样口温度、载气流量、分流比、进样量等色谱条件的优化，以期建立适用于准确、快速测定浓香型白酒中己酸含量的检测方法。通过开展精密度试验及不同加标水平下的己酸加标回收试验，对该检测方法的可行性进行确认。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

无水乙醇（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；2-乙基丁酸（纯度≥99.9%）、己酸（纯度≥99.5%）：阿拉丁试剂（上海）有限公司。

试验酒样（1号酒样38%vol、2号酒样40%vol、3号酒样42%vol、4号酒样52%vol）：江苏今世缘酒业股份有限公司的成品酒。

1.2 仪器与设备

Agilent 7890B气相色谱仪（配备毛细管柱分流/不分流进样系统及10 μL自动进样器）、氢火焰离子化检测器、CPWax 57CB（50 m×0.25 mm，0.20 μm）色谱柱：美国Agilent公司；BSA124S电子天平：德国Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 试剂配制

乙醇溶液（体积分数50%）：量取50 mL无水乙醇，用水定容至100 mL，混匀。

己酸标准储备液（43.500 mg/mL）：准确称取4.350 g（精确至0.001 g）己酸至100 mL容量瓶中，用乙醇溶液定容至刻度，混匀，0～4 ℃低温冰箱密封保存。2-乙基丁酸标准溶液（体积分数2%）：吸取2 mL2-乙基丁酸至100 mL容量瓶中，用乙醇溶液定容至100 mL，混匀，0～4 ℃低温冰箱密封保存。己酸系列标准工作液：分别吸取14.368 μL、28.736 μL、57.472 μL、114.944 μL、172.414 μL、229.888 μL己酸标准储备液于6个10 mL容量瓶中，用乙醇溶液定容至刻度，依次配制成己酸含量为0.062 5 mg/mL、0.125 0 mg/mL、0.250 0 mg/mL、0.500 0 mg/mL、0.750 0 mg/mL、1.000 0 mg/mL系列标准溶液，现配现用。

1.3.2 色谱条件

初始条件依据《浓香型白酒》国家标准（报批稿）附录B.1气相色谱法（第一法，仲裁法）设定：

柱温：初始温度35 ℃保持1 min，以3.5 ℃/min升至180 ℃，以15 ℃/min升至210 ℃，保持6 min；检测器温度：250 ℃；进样口温度：250 ℃；载气流量：1 mL/min；进样量：1.0 μL；分流比：20∶1。

实验过程中，分别采取改变升温方式和速率、进样口温度、载气流量、分流比、进样量单一条件的方式来评价对己酸分离条件的影响。根据综合判断评比得出相对报批稿更为优化的检测条件：

柱温：初始温度45 ℃保持8 min，以4 ℃/min升至130 ℃，以20 ℃/min升至200 ℃，保持15 min；检测器温度：250 ℃；进样口温度：200 ℃；载气流量：0.8 mL/min；进样量：0.5 μL；分流比：40∶1。

1.3.3 标准曲线的绘制

分别吸取10 mL己酸系列标准工作液于6个试管里，然后加入0.1 mL2-乙基丁酸标准溶液，混匀，测定己酸和内标2-乙基丁酸色谱峰面积，以己酸系列工作液的浓度为横坐标，以己酸和2-乙基丁酸色谱峰面积的比值为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.4 定性定量检测

调整Agilent 7890B气相色谱仪器至最佳工作状态，待仪器稳定后，吸取10 mL试样于试管中，加入0.1 mL 2-乙基丁酸标准溶液，混匀，进样检测。根据已知的己酸标准品在色谱图上的保留时间对白酒中的己酸进行定性分析，同时记录己酸和2-乙基丁酸色谱峰面积的比值，根据标准曲线得到试样中己酸的浓度。

2 结果与分析

2.1 色谱条件优化及定性检测

完全按照报批稿附录B中的色谱条件对己酸标样和2-乙基丁酸标样进行测定，结果如图1所示，采用优化后的色谱条件进行测定，结果如图2所示。由图1可知，己酸色谱峰的峰型较差，且色谱图出现明显的基线漂移，影响积分面积，进而影响数据的准确性。由图2可知，己酸色谱峰的峰型较好，同时基线漂移情况有明显改善。

将加过2-乙基丁酸内标的酒样注入气相色谱仪中，经检测，酒样中的己酸和2-乙基丁酸的保留时间分别为35.413 min和34.288 min，标样中己酸和2-乙基丁酸的保留时间分别为35.415 min和34.292 min，相对偏差分别为0.003%和0.006%，色谱峰保留时间匹配度较好。

图1 色谱条件优化前己酸和内标的色谱图Fig.1 Chromatogram of hexanoic acid and internal standard before chromatographic conditions optimization

图2 色谱条件优化后己酸的色谱图Fig.2 Chromatogram of hexanoic acid internal standard after chromatographic conditions optimization

表1 己酸和内标的保留时间差异Table 1 Difference of retention time between hexanoic acid and internal standard

2.2 校准曲线

图3 己酸的标准曲线Fig.3 Standard curve of hexanoic acid

以配制的己酸标样与2-乙基丁酸浓度之比为横坐标，以己酸标样和2-乙基丁酸色谱峰面积的比值为纵坐标，绘制己酸标准曲线，如图3所示。根据GB/T 27404—2008附录F技术要求，对于确认方法，校准曲线的相关系数≥0.99，该实验做出的校准曲线的相关系数为0.999 74，达到了国标GB/T 27404—2008的技术要求。

2.3 精密度试验

在优化的色谱条件下，对4个白酒样品分别进行6次平行检测，计算测定结果的平均值及相对标准偏差（RSD），结果见表2。由表2可知，4个白酒样品中的己酸测定结果RSD分别为1.317%、2.020%、1.999%、3.532%，表明采用优化后的色谱条件测定结果精密度良好。

表2 精密度试验结果（n=6）Table 2 Results of precision tests (n=6)

2.4 加标回收试验

分别向装有10 mL酒样的试管中加入0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL己酸标准储备液（浓度为43.500 mg/mL），按照优化的气相色谱条件，平行测定6次，计算平均回收率。加标测试结果见表3。由表3可知，在0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL三个加标水平下，1号酒样的平均回收率分别为96.1%、98.2%、102.9%，2号酒样的平均回收率分别为101.1%、98.9%、101.9%，3号酒样的平均回收率分别为99.4%、99.6%、101.3%，4号酒样的平均回收率分别为102.8%、99.2%、101.0%，表明采用优化后的条件测定结果准确度良好。

表3 加标回收率试验结果（n=6）Table 3 Results of adding standard recovery rate tests (n=6)

3 结论

该方法运用毛细管柱气相色谱仪，依据《浓香型白酒》国家标准（报批稿）附录B《白酒中己酸含量的测定方法》中气相色谱法（第一法仲裁法），通过对色谱条件的优化，建立了浓香型白酒中的己酸的检测方法。采用标准物质和保留时间进行物质的定性，以内标法和多点校正进行白酒中己酸含量的检测。参照GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范食品理化检测》附录F要求，在该方法检测条件下，己酸的精密度试验结果相对标准偏差在0.132%～0.353%之间，回收率在96.1%～102.9%之间（n=6），符合GB/T 27404—2008检测方法确认的技术要求，说明建立的测定白酒中己酸的方法符合《浓香型白酒》国家标准的要求，可以用于浓香型白酒中的己酸含量的检测。