高压氧对蛛网膜下腔出血大鼠模型基底动脉痉挛的作用及机制

赵龙，朱茜，唐晓平（通讯作者）

（1. 川北医学院附属医院 神经外科，四川 南充 637000；2. 川北医学院附属医院 神经外科研究所，四川 南充 637000；3. 川北医学院附属医院 护理部，四川 南充 637000）

0 引言

高压氧（hyperbaric oxygen，HBO）作为一种有效的神经修复与保护措施已经被广泛应用于多种神经外科疾病中，临床报道显示，HBO 可以明显改善患者预后，减轻脑损伤[1]。在蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）患者中，已有报道表明HBO 可以减轻脑血管痉挛（cerebral vasospasm，CVS），改善患者神经功能[2]，但对其作用机制的研究仍较少。本研究拟通过动物实验观察HBO 对SAH后基底动脉痉挛的影响，并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验对象与分组。清洁级成年雄性SD 大鼠90 只，随机均分为对照组、假手术组、HBO 组。各组再根据干预终止时间分为1 d、3 d、5 d、7 d、14 d 亚组。

1.2 主要干预措施。采用枕大池二次注血法建立SAH 模型，造模方法按照之前文献描述进行[3]，分两次枕大池抽取脑脊液0.3 mL 后注射等量自体动脉血。假手术组操作步骤同上，以无菌生理盐水代替自体血。HBO 组大鼠在第二次注血后当天接受高压氧治疗，每天一次，每次80 分钟，对照组常规饲养。

1.3 外周血NO 含量测定。使用NO 测试试剂盒（化学法，南京建成）测定血清NO 浓度。

1.4 基底动脉的组织学观察及血管内径测定。取基底动脉末端切片行HE 染色，400 倍显微镜下，观察基底动脉管壁组织学特点，并在100 倍光镜下用接目测微尺测量基底动脉的最大内径与最小内径，以公式：校正管径=（最大内径＊最小内径）1/2 计算基底动脉校正管径。

1.5 内皮型一氧化氮合成酶（eNOS）的测定。选择术后5天亚组大鼠基底动脉切片以免疫组化法检测eNOS 水平。基底动脉切片经脱蜡、水化、EDTA 抗原修复液（迈新生物，福州）修复抗原后，采用羊抗小鼠Streptavidin-HRP 试剂盒（康为世纪，北京）、抗大鼠eNOS 单克隆抗体（BD 生物，美国）、增强型HRP-DAB 底物显色试剂盒（天根生物，北京）等进行免疫组化染色。应用IPP 6.0 图像分析软件测定阳性细胞的平均光密度值（AOD）来表示抗原表达量。

1.6 统计学分析。采用SPSS 22.0 进行统计学分析，计数资料以均数±标准差表示。两组间比较采用成组分析t 检验，多组间比较采用单因素方差分析，SNK-q 检验进行两两比较，以双侧P＜0.05 认为有统计学意义。

2 结果

2.1 基底动脉组织学观察假手术组基底动脉周围无血凝块，血管壁结构正常：内膜平滑，内弹力膜完整，中层可见2-3 层平滑肌细胞均匀分布，外膜薄且平滑。对照组术后1 d 蛛网膜下腔可见大量红细胞，血管周径、血管壁厚度及内皮细胞形态改变尚不明显；术后3 d、5 d 可见蛛网膜下腔红细胞及炎细胞聚集，血管管腔明显变窄，血管壁增厚，内皮细胞出现不同程度的变性、肿胀、染色质不均，胞浆内空泡形成；内弹力膜迂曲、皱褶甚至断裂，厚薄不均，中膜增厚，平滑肌细胞排列紊乱。术后7 d 上述情况有所好转，术后14 d 基本恢复正常。HBO 组术后3 d、5 d 可见类似于对照组变化，但程度较轻。

2.2 各组血管内径比较，见表1。对照组血管内径值进行性减小，至术后5d 达其最低值，而假手术组各时间点血管内径一致，说明SAH 组大鼠基底动脉发生了CVS，其痉挛高峰为术后5 d，术后7 d 血管内径仍明显低于假手术组（P＜0.05）。HBO 组基底动脉内径也逐渐变小，其痉最低值出现在术后3 d，变化程度较SAH 组轻（P＜0.05）；术后5 d 及术后7 d，血管内径值明显高于SAH 组（P＜0.05），术后7 d 血管内径与假手术组间无差异（P＞0.05）。

2.3 术后5 d 基底动脉内皮细胞eNOS 染色程度比较。eNOS 阳性表现为均匀性棕黄色或棕褐色胞浆着色，主要表达于血管内皮层，脑膜及动脉外膜也可见阳性表达。假手术组术后5 d 组基底动脉内皮层可见均匀黄染；SAH 组术后5 d 可见基底动脉内皮层着色浅，染色不均；HBO 组内皮层染色不均，阳性染色较SAH 强。对照组、假手术组、HBO组AOD 值 分 别 为（0.156±0.069）、（0.414±0.102）、（0.299±0.067），组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较，对照组、HBO 组均较假手术组低，差异有统计学意义（P＜0.05）；HBO 组AOD 值较对照组高，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 基底动脉校正内径变化

表1 基底动脉校正内径变化

注：⋆与假手术组比较，P<0.05；■与对照组比较，P<0.05。

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2.4 外周血NO 浓度比较。假手术组各亚组之间NO 浓度无明显差异（P＞0.05）。对照组术后5 d 内NO 浓度进行性降低，术后5 d 达最低值，然后逐渐升高，术后7 d 仍低于假手术组（P＜0.05），术后14 d 与假手术组比较无统计学差异（P＞0.05）。HBO 组术后NO 浓度也降低，术后3 d 达到最低值，然后逐渐上升，术后7d 与假手术组比较无统计学差异（P＞0.05），术后3d、5d、7d 均较对照组高，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 外周血NO 水平比较

表2 外周血NO 水平比较

注：⋆与假手术组比较，P<0.05；■与SAH 组比较，P<0.05。

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3 讨论

SAH 后CVS 是大脑动脉血管在出血后理化因素共同作用下发生的病理性收缩，通常为可逆性的过程，而在临床上迟发性CVS 对患者的预后有重大影响。CVS 在发病后3 天开始出现，7 天左右达到高峰，持续至14 天左右基本恢复。我们采用枕大池二次注血法建立SAH 后CVS 模型，通过对照组观察，成功模拟了这一病理变化过程，也为进一步研究HBO 的作用及机制创造了条件[4]。CVS 的发生发展受到多重因素影响，氧合血红蛋白的产生与分解为CVS 提供了物质基础，过量的氧自由基产生并激活PKC 和Rho 激酶，激活平滑肌细胞膜上的钙通道，导致平滑肌细胞收缩是其主要病理生理机制。另外，胆红素氧化产物增加、不对称二甲基精氨酸代谢异常及血管内皮细胞损伤及功能障碍共同导致的NO代谢障碍也是CVS 产生及持续的重要原因。

HBO 自上世纪90 年代开始用于治疗动脉瘤性SAH 患者，报道称HBO 结合适当扩容、高血压可以减轻症状性CVS。继而逐渐有文献报道了HBO 有助于SAH 患者的临床恢复[5]但是，对于其机制的研究大多集中在HBO 对脑缺血性损害及继发性脑损害的作用上，而直接研究HBO 对CVS的作用及机制的报道较少。

我们的实验结果表明，HBO 可以减轻SAH 后CVS 的程度，促进CVS 的恢复，而且，其对CVS 的作用与升高血、脑脊液NO 浓度有关。为了进一步明确NO 浓度升高的机制，我们采用免疫组织化学方法检测了血管内皮细胞eNOS 表达情况，结果表明，CVS 发生后，血管内皮细胞表达eNOS 明显减少，这与之前的研究结果一致[6]。而HBO 组CVS 减轻的同时，eNOS 染色强度也有所增加。这说明，HBO 可能通过提高痉挛血管内皮eNOS 的活性而促进NO 的合成。研究结果证实了HBO 对CVS 的作用，并初步解释了其作用与NO 代谢的关系，研究结果支持HBO 在动脉瘤性SAH 术后患者的推广应用，也有助于推动相关研究的进一步深入，为更安全高效的利用HBO 提供线索与依据。