猪肺源致病性大肠杆菌和化脓隐秘杆菌混合感染病原的分离鉴定及主要毒力因子的检测

蔡瑶 周雪珂 江朝源 曾喻兵 徐志文 朱玲

关键词：猪;肠外致病性大肠杆菌;化脓隐秘杆菌;分离鉴定;混合感染;毒力基因

中图分类号：S852.61+2

文献标识码：A文章编号：1000-4440（2020）01-0254-03

Key words：pig;extraintestinal pathogenic Escherichia coli;Trueperella pyogenes;isolation and identification;mixed infection;virulence gene

大肠杆菌是一种重要人畜共患病病原体，可感染人和多种动物，根据其对宿主寄生部位不同，划分为肠内致病性大肠杆菌和肠外致病性大肠杆菌（ExPEC）[1]。近几年来，国内外众多学者陆续报道了关于ExPEC的感染案例，指出其可特异性定殖于宿主肠道外，使感染宿主发生不同程度的脑膜炎、败血症、泌尿道及呼吸道感染[2]。目前在ExPEC中发现了多种毒力因子，包括与其致病性相关的毒力岛（PAI）、黏附素、侵袭素、毒素、表面抗原、铁摄取系统和分泌系统等[3]。

化脓隐秘杆菌（Trueperella pyogenes，原名Arcanobacterium pyogenes）又名化脓放线菌或化脓棒状杆菌，为隐秘杆菌属（Trueperella）细菌。可以感染牛、羊、猪、林麝等重要经济动物，也可以感染人，是一种机会致病菌[4]。化脓隐秘杆菌可在家畜间广泛传播，常引起感染动物化脓性肺炎及乳房炎、心内膜炎、关节炎、多发性淋巴结炎，甚至会造成宿主流产和不孕等，最严重时可引发脓毒败血症导致家畜死亡[5]。目前已发现的化脓隐秘杆菌毒力因子有 4 类，分别为化脓隐秘杆菌溶血素（PLO）、胶原结合蛋白质（CbpA）、神经氨酸酶（Nan）及菌毛合成蛋白质（Fim）[6]。

秋季早晚温差大，猪群发生呼吸道疾病的可能性增加，发病的原因也是多种多样，多数由细菌、病毒或寄生虫等感染，甚至由多种病原混合感染诱发[7]。2018年10月，四川省蒲江地区某规模化养猪场部分猪只出现严重的呼吸道症状，包括仔猪、保育猪、母猪均有发病，具体表现为呼吸急促且伴随厚重的喘气声，耳部发绀，眼部、鼻腔部黏液增多，采食减少，体温升高，最后因呼吸衰竭而亡。采用常用细菌分离方法结合16S rRNA基因序列分析综合鉴定病原菌，分离出1株肠外致病性大肠杆菌和1株化脓隐秘杆菌。为详细了解细菌毒力情况，对这2种菌进行特异性毒力基因检测，同时选用常用抗生素对分离菌进行药敏试验，为临床用药提供依据。

1材料和方法

1.1样品来源

样品来源于四川省蒲江某猪场发病濒死保育猪，无菌采集病猪心脏、肺脏、肝脏及肺门淋巴结、脾脏备用。

1.2細菌16S rRNA基因的扩增及系统发育树构建

细菌基因组DNA的提取按试剂盒说明书进行。细菌16S rRNA通用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，F-16S rRNA为5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，R-16S rRNA为5′- TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′，预期扩增长度为1 465 bp。反应体系（30 μl）：上、下游引物各0.5 μl（20 μmol/L），细菌基因组1.5 μl（634 ng/μl），2×Taq PCR MasterMix 15.0 μl，ddH2O 12.5 μl。反应条件：95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30个循环;72 ℃ 7 min。

PCR产物用回收试剂盒回收片段，与pMD-19T载体16 ℃过夜连接，之后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆后送至上海生物工程公司测序。将测序结果与GenBank数据库中已发表菌株序列进行比对分析。

1.3分离株毒力因子的检测及测序

根据文献[8]～[10]所设计的9对肠外致病性大肠杆菌（ExPEC）毒力基因papA、sfaS、focG、iutA、hlyD、afa、fyuA、ireA、vaT特异性引物，同时根据Zastempowska等[11]、徐凝等[12]设计的8对化脓隐秘杆菌的毒力基因plo、nanH、nanP、cbpA、fimA、fimC、fimE、fimG特异性引物检测两种细菌的毒力基因，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。分别以大肠杆菌和化脓隐秘杆菌基因组为模板进行毒力因子的扩增，产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

1.4药敏试验

参照CLSI标准[13]，采用纸片扩散法测定两株菌对临床上常用抗生素的敏感情况，测量抑菌圈的直径，判定药敏试验结果。

2结果与分析

2.1分离株16S rRNA基因扩增结果及进化树分析

提取分离菌株DNA，用16S rRNA基因通用引物扩增出1 465 bp的目的片段，测序后将结果与GenBank上已发表序列进行同源性分析。结果显示疑似大肠杆菌菌株（MS-1）与大肠杆菌CP022959.1同源性达99%且位于一个分支上，疑似化脓隐秘杆菌菌株（MS-2）与化脓隐秘杆菌CP007519.1同源性达99%且位于一个分支上。确认分离到1株大肠杆菌和1株化脓隐秘杆菌，且由于大肠杆菌是从患病猪的肺部病变区域中分出，在病猪肠道并未发现明显的病变，初步判定该大肠杆菌为肠外致病性大肠杆菌（ExPEC）。

2.2分离菌株毒力因子扩增结果

以大肠杆菌基因组为模板，对9种毒力因子进行PCR检测，结果扩增出iutA（314 bp）、fyuA（787 bp）基因，未扩增出papA、sfaS、focG、hlyD、afa、ireA、vaT基因;以化脓隐秘杆菌基因组为模板，对8种毒力因子进行PCR检测，扩增出plo （150 bp）、nanH （1004 bp）、fimA （605bp）、fimC（843bp）、fimG（929bp）基因，未扩增出nanP、cbpA、fimE基因。

2.3药敏试验

分别对分离出的大肠杆菌和化脓隐秘杆菌进行常用抗生素的敏感性试验，根据杭州天和微生物试剂有限公司的药敏试验纸片法抑菌范围解释标准进行药物敏感性判断，结果显示两种菌对庆大霉素、头孢噻肟以及氟苯尼考均表现敏感。

3讨论

根据发病情况、临床症状以及实验室常用细菌分离和16S rRNA基因序列测定结果，结合之前实验室检测结果（未发现患病猪有寄生虫感染迹象，且常见呼吸道病毒性疾病检测结果全部为阴性），综合判定该猪场疫情由大肠杆菌和化脓隐秘杆菌混合感染造成。

有研究者认为，从动物肠道以外的脏器中分离到的大肠杆菌均可判定为ExPEC，也有人提出可根据大肠杆菌携带的特定毒力基因种类和数量初步确定是否为ExPEC[14]。在本研究中，我们从猪肺脏中分离出1株具有较强致病性的大肠杆菌，通过基因检测发现该大肠杆菌具有iutA、fyuA 2种毒力基因，综合判定其为肠外致病性大肠杆菌。iutA是大肠杆菌代谢相关毒力基因，是铁摄取蛋白系统中的一种基因，对细菌的生存至关重要。fyuA基因也参与铁的摄取，是耶尔森强毒力岛（HPI）中的核心结构和功能基因，与大肠杆菌毒力的进化密切相关[3]。Jost等[4]研究结果表明，化脓隐秘杆菌的毒力是由多种毒力因子决定的，各类毒力基因具有协同作用，并且细菌可以在不同宿主中差异表达各种毒力基因而引发不同的感染症状。本研究中分离出的化脓隐秘杆菌中检测出8种毒力基因中的5种（plo、nanH、fimA、fimC、fimG），其中plo编码的溶血素（plo）是一种细菌外毒素，能够裂解多种动物的红细胞、免疫细胞，引起动物皮肤坏死最终死亡。神经氨酸酶nanH也具有多种毒力作用：分解宿主唾液酸作为碳源提高自身在宿主的生存力;降低细胞膜表面的黏滞性，促进其对宿主细胞的感染力;分解免疫球蛋白IgA，降低宿主防御能力。针对化脓隐秘杆菌菌毛合成蛋白质的研究还不够深入，只知道其与细菌的黏附作用相关，目前已报道的4种化脓隐秘杆菌菌毛合成蛋白质中，本研究分离的菌株中含3种，推测该菌可能具有较强的黏附性。

大肠杆菌是猪临床中较为常见的一种传染病原，以往也有肠外致病性大肠杆菌引发猪肺炎的病例报道[15]，而化脓隐秘杆菌感染的案例在林麝、牛、羊中报道的较多，对猪感染的案例相对较少。但近年来，国内报道从猪呼吸道疾病中分离出化脓隐秘杆菌的频率也逐年提高[16-19]。在林麝[20]、奶牛[21-22]中有报道大肠杆菌会同化脓隐秘杆菌混合感染，尤其是奶牛，在大多数患有乳房炎和子宫炎的奶牛中都能分离出大肠杆菌和化脓隐秘杆菌。但是，在猪呼吸道疾病中却几乎没有大肠杆菌同化脓隐秘杆菌混合感染的病例报道，本研究发现这2种細菌在猪中的混合感染，对今后猪病的研究具有较好的参考价值。Jost等[4]在对机会致病菌化脓隐秘杆菌的研究中也发现，化脓隐秘杆菌不是具有实质致病潜力的细菌，往往同其他病原体共同感染导致宿主发病。Zerbe等[21]和Bicalho等[22]在大肠杆菌和化脓隐秘杆菌的毒力因子与奶牛子宫疾病的关系研究中发现，大肠杆菌感染后会抑制奶牛子宫中性粒细胞的功能，很有可能是大肠杆菌先感染奶牛子宫造成子宫内环境发生变化，从而给化脓隐秘杆菌提供适宜的生存条件，继发感染导致子宫内膜炎的加重和生殖功能衰竭。Wagener等[23]研究发现并不是所有大肠杆菌都会促进化脓隐秘杆菌的感染，而只有肠外致病性大肠杆菌菌株（ExPEC）才能促进化脓隐秘杆菌感染。对小鼠的致病性研究结果表明，两种菌混合感染会相互加强毒力。而药物敏感性试验结果显示，两种菌对庆大霉素、头孢噻肟以及氟苯尼考均表现敏感，这3种药物对两种病原菌均可能具有较强的杀灭作用。

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（責任编辑：张震林）