基于成分检测的大黄-蜇虫药对最佳配伍比例的研究

孟雨婷，李华，陈志颖，吴玉玲，石航，张玲

基于成分检测的大黄-蜇虫药对最佳配伍比例的研究

孟雨婷，李华，陈志颖，吴玉玲，石航，张玲

（山东中医药大学， 山东 济南 250355）

目的：研究大黄-蜇虫不同比例配伍对水提液中有效成分的影响，探求药对的最佳配伍比例。方法：采用HPLC法考察大黄-蜇虫药对不同比例配伍共提液中大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量变化情况；通过高速氨基酸分析仪分析大黄-蜇虫药对不同比例配伍共提液中氨基酸的含量及组成；采用极差归一化法，对不同比例配伍的大黄-蛰虫药对中大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、总氨基酸的含量进行综合分析，优选出最佳配伍比例。结果：大黄-蜇虫（1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1）九个比例配伍进行综合分析后，确定在大黄-蜇虫配伍比例为1:3时有效成分含量最高。结论：大黄-蜇虫药对最佳配伍比例为1∶3。

大黄；蜇虫；有效成分；配伍比例

大黄（Rheum palmatum L.），为蓼科大黄属多年生草本，药用部位通常为大黄的根状茎及根[1-3]，味苦而微涩，性寒，具有排除积滞、破血逐淤、通络的功能[4-8]。适宜生长在清冷凉爽的地区，可以忍受寒冷，但是炎热的地区不适合大黄的生长，大黄主要生长于林地边缘[9]。蛰虫（Eupolyphaga sinensis Walker），别名地鳖虫、土鳖、土元等，地鳖蠊科昆虫地鳖或冀地鳖的雌虫干燥体，性寒味咸，有一定的毒性，使用时要注意用量且不能长期使用[10]，具有破淤通经的功效，主要用于女性月经不调、产后瘀阻、淤血肿痛等症状。

近年来女性由于输卵管不通、子宫肌瘤、卵巢囊肿等导致的不孕患者增多，其病机关键是瘀血内阻。中医临床用药经验证明，破血消癥类药物对于破淤消积方面的效果要比活血化瘀类药物的效果好得多。大黄-蛰虫药对，具有攻积导泻、通经消癥的作用，是中医临床常用药对。大黄入血偏于泻，有破除瘀血的作用；蛰虫入血偏于通，有疏通经络的作用；大黄、蛰虫配合使用，使得受阻的脉络畅通，体内积滞的瘀血可以消散[11-12]。目前少有对大黄-蛰虫对药配伍后化学成分的监测的报道，本实验旨在通过对大黄-蛰虫对药不同比例配伍后有效成分的含量和组成的变化探讨其配伍规律，为中医临床应用提供更有利的支撑。

1 仪器与试剂

高效液相色谱仪：LC-10ATVP（日本岛津公司）；高速氨基酸分析仪：L-8900（日本株式会社日立高新技术科学那珂事务所）；高速冷冻离心机：ST16R（赛默飞世尔科技有限公司）；大黄素对照品：上海源叶生物科技有限公司，批号：T02S8F42983。

大黄酚对照品：上海源叶生物科技有限公司，批号：T23A8F42188；大黄素甲醚对照品：上海源叶生物科技有限公司，批号：T09M9F55482；5-磺基水杨酸：上海源叶生物科技有限公司，批号：Y07M9C55033；甲醇（色谱纯）；蜇虫：安国市聚药堂药业有限公司，批号：1809003；大黄：安国市聚药堂药业有限公司，批号：1809006；大黄、蛰虫药材经山东中医药大学张芳副教授鉴定，均为正品药材。

2 实验方法与结果

2.1 大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的含量测定

使用高效液相色谱仪分别对混合标准品溶液和供试品溶液进样分析，混合标准品溶液中大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的浓度可由称取的重量和稀释倍数求得，由高效液相色谱仪进样分析生成的报告可得分别得到的峰面积，由此可得浓度-峰面积的线性回归方程；根据进样分析得到的供试品溶液中的大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的峰面积，由线性回归方程可分别求得其浓度，进而求得1 g药材中指标性成分的含量。

2.1.1 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAXODS（4.6×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）-0.1%磷酸溶液（B）（85:15）；紫外检测波长：254 nm；体积流量：1 mL·min-1；柱温：室温；进样量：20 μL。色谱图如图1所示。

1-大黄素；2-大黄酚；3-大黄素甲醚a. 混合对照品溶液；b. 样品溶液

2.1.2 对照品溶液的制备

精密称取大黄素对照品、大黄酚对照品、大黄素甲醚对照品适量，分别放置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，超声溶解，摇匀，制成质量浓度分别为0.100，0.102，0.086 mg·mL-1的混合对照品溶液。置冰箱中4 ℃保存备用。

2.1.3 供试品溶液的制备

取大黄、蛰虫适量，粉碎，分别按不同配伍比例（1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1，1∶2，3∶1，4∶1，5∶1）称取粉碎后的大黄、蛰虫，混匀，分别置烧杯中加适量蒸馏水浸润30 min，后加入圆底烧瓶中，加10倍量蒸馏水，沸腾后再煎煮30 min，倒出；后加100 mL蒸馏水，沸腾后煎煮30 min，合并2次提取液，置离心管中离心去除部分沉淀，上清液旋蒸浓缩至50 mL。各取25 mL于圆底烧瓶中，加100 mL甲醇，称重，加热回流1 h时，取下冷却，称重，甲醇补足失重，过滤，滤液过0.45μm微孔滤膜，作为供试品溶液。

2.1.4 标准曲线的绘制

精密吸取“2.1.2”项下的各对照品溶液，制成大黄素浓度为1.0, 2.0, 5.0, 10.0, 20.0, 25.0 μg·mL-1，大黄酚浓度为8.0, 16.0, 25.5, 30.6, 35.7, 45.9 μg·mL-1，大黄素甲醚浓度为1.72, 4.3, 8.6, 10.32, 12.9, 17.2 μg·mL-1的混合对照品溶液，进样20 μL，按“2.1.1”项下色谱条件进行测定分析，分别以对照品浓度为横坐标（）、峰面积为纵坐标（）进行线性回归分析（=6），大黄素：=300 99-136 07（=0.999 5）, 大黄酚：=405 17+105 607（=0.999 6），大黄素甲醚：=268 04+663.49（=0.999 6）。结果表明大黄素在1.000~25.000μg，大黄酚在8.000~45.900μg，大黄素甲醚在1.720~17.200μg线性关系良好。

2.1.5 精密度试验

取大黄-蛰虫（1∶1）配伍比例的供试品溶液，连续进样6次，记录大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的峰面积并计算RSD分别为0.98%, 1.22%, 0.76%。表明仪器精密度良好。

2.1.6 稳定性试验

取大黄-蛰虫（1∶1）配伍比例的供试品溶液，于制备后的0, 2, 4, 8, 12, 24 h分别进样测定大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的峰面积并计算RSD分别为1.45%, 1.67%, 1.55%。表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.1.7 重复性试验

精密称取大黄-蛰虫（1∶1）配伍比例的样品6份，按“2.1.3”项下的方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件分别测定大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的峰面积并计算RSD分别为1.21%, 1.56%, 0.96%。表明此实验药材有效成分提取方法及检测方法的重复性良好。

2.1.8 加样回收率试验

精密称取大黄-蛰虫（1∶1）配伍比例的样品约5 g，共6份，分别加入质量浓度为0.201 mg·mL-1的大黄素对照品溶液、质量浓度为0.318 mg·mL-1的大黄酚对照品溶液和质量浓度为0.110 mg·mL-1的大黄素甲醚对照品溶液各5 mL，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件测定大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的峰面积，计算各平均加样回收率分别为98.77%, 98.23%, 97.59%， RSD分别为2.30%, 2.11%, 1.96%。

2.2 蜇虫中游离氨基酸的含量测定

使用高速氨基酸分析仪进样分析氨基酸标准品溶液和不同配伍比例的供试品溶液中游离氨基酸的含量，进样量为20 μL，分析结果可直接得到20 μL中各游离氨基酸的含量及总含量，进而可求得1 g药材中总氨基酸的含量。

2.2.1 色谱条件

交换柱:（4.6 mm×60 mm, 3μm）磺酸型阳离子树脂分离柱；泵1（洗脱溶液）流速: 0.40 mL·min-1（压力2.0~14.7 MPa）； 泵2（茚三酮溶液）流速: 0.35 mL·min-1（压力0.2~2.0 MPa）；分析柱温度: 57 ℃；反应器温度: 135 ℃；进样体积: 20 μL；检测波长: 570 nm，其中脯氨酸检测波长为440 nm。色谱图见图 2。

a. 混合对照品溶液；b. 样品溶液

2.2.2 对照品溶液的制备

分别移取氨基酸混合溶液-A型、氨基酸混合溶液-B型各40μL于EP管中，再精密移取0.2% 的盐酸溶液920 μL至EP管中补足1 mL，将EP管斡旋30 s，用1 mL注射器吸出EP管内溶液过0.22 μm滤膜置进样瓶中，对照品溶液配置完成。

2.2.3 供试品溶液的制备

取“2.1.3”项下旋蒸浓缩后的溶液各300 μL于离心管中，后称取约4.5 g 5-磺基水杨酸分别加入，精密移取600 μL 0.2%盐酸溶液分别置于离心管中，混匀，放置1 h，后于离心机中离心20 min，转速为12 000 r·min-1，取上清液过0.22 μm滤膜，作为供试品溶液。

2.2.4 样品的测定

取“2.1.3”项下制备的供试品溶液，按“2.2.1”项下的色谱条件分别进行测定，进样量为20 μL，计算大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量，平行测定3次，结果见表1。

表 1 大黄-蛰虫药对不同配伍比例大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量测定结果

取“2.2.3”项下制备的供试品溶液，按“2.2.1”项下的色谱条件分别进行测定，进样量为20 μL，计算游离氨基酸的含量，平行测定3次，结果见表2、表3，表中列出了17种常见氨基酸和测定的38种游离氨基酸的总和。

采用极差归一化的方法，对不同比例配伍的大黄-蛰虫药对中大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、总氨基酸的含量进行综合分析，优选出最佳配伍比例，结果见表4。

表2 大黄-蛰虫药对不同配伍比例游离氨基酸的含量测定结果

表3 大黄-蛰虫药对不同配伍比例游离氨基酸的含量测定结果

3 结 论

由表1可知，大黄-蛰虫药对中大黄素的含量在配伍前后及不同配伍比例中的差异较小，仅配伍比例为1∶2，1∶3，2∶1时的含量较配伍前增多；大黄酚的含量在不同配伍比例中均有所增加，其中以配伍比例为1∶2，1∶3，1∶5时含量增加最为显著；大黄素甲醚的含量在不同配伍比例中亦均有所增加，增加趋势并不明显。

表4 大黄-蛰虫药对不用配伍比例指标成分含量归一化结果

由表2、表3可知，总游离氨基酸的含量在大黄-蛰虫配伍比例为5∶1，4∶1时的含量最高，配伍比例为1∶2时的含量最低，其中丝氨酸、丙氨酸、精氨酸、脯氨酸的含量随大黄所占比例的增加而有显著的增加，含量变化明显。由表4极差归一化后的结果可知，当大黄-蛰虫配伍比例为1∶3时结果最好，说明大黄-蛰虫配伍后有促进有效成分溶出的作用，且配伍比例不同促进溶出的作用也不同，其中以大黄：蛰虫为1∶3时效果最佳。

药对为中医临床常用的用药形式，是在千百年的临床用药中总结归纳出的药物配伍[13-14]。药物的配合使用，不但可以提高药物有效成分的溶出以提高药物疗效，而且可以降低毒性或副作用。大黄-蛰虫药对的使用历史久远，从古至今，很多复方中都含有此药对，在现代，其应用更加广泛。现代研究表明，大黄-蛰虫药对在在治疗西医疾病方面也有良好的疗效：抗肝纤维化，在治疗慢性肝炎、肝硬化方面有一定的疗效；对妇科疾病的治疗，对月经不调、卵巢囊肿、不孕不育等治疗效果确切；对心血管疾病有治疗作用，降低血液粘度，改善微循环，有抗血栓、抗动脉粥样硬化、降血脂的功效；配合西药，对肿瘤，慢性肾衰竭等也有一定的治疗效果，可以提高患者的生存质量，改善患者机体功能；同时，大黄-蛰虫对黄褐斑等皮肤疾病也有很好的疗效[15-23]。大黄-蛰虫具有排除积滞、破淤通经的功效，且副作用较小，可以广泛用于符合其发病机理的各系统疾病中。大黄-蛰虫药对的应用日趋广泛，配伍比例的不同影响其药效的高低，确定其最佳配伍比例有很明确的研究意义。本实验的创新点在于从成分检测方面通过氨基酸测定仪测定哲虫中的有效部位总氨基酸，结合大黄中的大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量测定，采用极差归一化法综合分析大黄-哲虫最佳配伍比例，希望本实验所用的研究方法、数据处理方法可以为更多的研究提供方法，本实验探究的大黄-蛰虫药对的最佳配伍比例可以为临床用药提供一定的借鉴。通过对此方面的研究，让大黄-蛰虫药对更好的应用于临床，造福于人类。

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Study on the Optimum Compatibility Ratio of Dahuang-Zhechong Based on Component Detection

,,,,SHI Hang, ZHANG Ling

（Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Shandong Jinan250355, China）

To study the effect of different compatibility ratios of Dahuang-Zhechong on the content of active ingredients in water extract, and to explore the best compatibility ratio, HPLC was used to investigate the content changes of emodin,chrysophanol and physcion in the extracts with different compatibility ratios of Dahuang-Zhechong;the content and composition of amino acids in different compatibility ratios of Dahuang-Zhechong were analyzed by high-speed amino acid analyzer; the range normalization method was used to comprehensively analyze the contents of emodin,chrysophanol and physcion and total amino acid in different compatibility ratios of Dahuang-Zhechong,and the optimal compatibility ratio was selected. The results showed that, after comprehensive analysis of the nine compatibility ratios（1∶1, 1∶2, 1∶3, 1∶4, 1∶5, 2∶1, 3∶1, 4∶1, 5∶1）of Dahuang-Zhechong, it was determined that the effective component content was the highest under the ratio of 1:3,so the best compatibility ratio of Dahuang-Zhechong was 1∶3.

Dahuang；Zhechong ;active component;compatibility ratio

山东中医药大学大学生创新训练计划，项目号：2018054；国家级大学生创新创业训练计划，项目号：201810441004。

2019-10-28

孟雨婷（1997-），女，安徽省宿州市人，研究方向：中药学

张玲（1980-），女，山东省胶州市人，讲师，博士，研究方向：从事中药及天然药物有效成分的研究。

TQR284.2

A

1004-0935（2020）01-0028-05