miR-374a-3p靶向Syk对ox-LDL诱导内皮细胞损伤及炎症反应的影响

冯自波 祝友鹏 张静

血管内皮细胞是血管壁的屏障，血管内皮细胞损伤与心血管疾病的发生密切相关［1］。研究发现miRNA 参与调控血管内皮细胞功能［2］。氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）处理人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）中miR-374a 下调表达［3］。miR-374a 可通过抑制氧化应激和抑制细胞凋亡来保护PC12 细胞免受缺氧性损伤［4］。miR-374a 可保护小鼠免于心肌缺血/再灌注损伤［5］。脾酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase，Syk）是一种非受体型酪氨酸激酶，与血管内皮功能及炎症反应有关［6］。抑制Syk 表达可降低小鼠炎症反应和动脉粥样硬化［7］。然而miR-374a-3p 和Syk 对人脐静脉内皮细胞损伤及炎症反应的影响及机制尚不清楚，本实验通过用ox-LDL诱导HUVEC 建立氧化损伤模型，研究miR-374a-3p 和Syk 对ox-LDL诱导的HUVEC 损伤及炎症反应的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

人脐静脉内皮细胞（HUVECs）购自美国菌种保藏中心；胎牛血清、DMEM 培养基、胰蛋白酶、ox-LDL 购自美国Sigma公司；LipofectamineTM2000 转染试剂盒、荧光定量试剂盒购自美国Invitrogen 公司；二辛可宁酸（BCA）试剂盒、膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（Annexin V-FITC）和碘化丙锭（PI）试剂盒、四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）试剂盒、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；抗体均购自上海煊翎生物科技有限公司；载体质粒购自上海基屹生物科技有限公司；酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂盒、双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自上海联科生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与分组

用含10%胎牛血清的DMEM 培养基于37℃、5%CO2下培养HUVEC，2 d 换液一次，用终浓度为50 μg/mL 的ox-LDL 培养HUVEC 细胞48 h，作为ox-LDL 处理组，正常培养的细胞作为对照（Con）组。将miR-NC、miR-374a-3p、anti-miR-NC、antimiR-374a-3p 转染至HUVEC 中，分别记为miR-NC组、miR-374a-3p 组、anti-miR-NC 组、anti-miR-374a-3p 组；将miR-NC、miR-374a-3p、si-NC、si-Syk 转染至HUVEC 后再用50 μg/mL 的ox-LDL 处理，记为ox-LDL+miR-NC 组、ox-LDL+miR-374a-3p 组、ox-LDL+si-NC 组、ox-LDL+si-Syk 组；将miR-374a-3p 与pcDNA3.1、pcDNA3.1-Syk分别共转染至HUVEC 后再用50 μg/mL的ox-LDL处理，记为ox-LDL+miR-374a-3p+pcDNA3.1 组、ox-LDL+miR-374a-3p+pcDNA3.1-Syk 组；转染均按照LipofectamineTM2000 试剂盒进行操作。

1.2.2 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测miR-374a-3p 表达水平

细胞培养48 h 后提取总RNA，反转录成cDNA，按照荧光定量试剂盒说明书进行PCR 扩增，每个样品设3个复孔，循环条件为95℃30 s，60℃30 s；72℃30 s，共40 个 循环；72℃延 长5 min。相对表达量采用2-△△Ct法计算。miR-374a-3p以U6 为内参，miR-374a-3p 上游引物序列：5′-TACATCGGCCATTATAATA-3′，下游引物序列：5′-TACACAGAATTACAATAC-3′；U6上游引物序列：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物序列：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.2.3 蛋白质印迹（Western Blot）检测Syk、Bax、Bcl-2 蛋白表达水平

细胞培养48 h 后提取总蛋白，BCA 试剂盒测定蛋白浓度，蛋白经10% SDS-PAGE 转至PVDF上，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入一抗，4℃孵育过夜，TBST 洗膜；加入二抗室温孵育90 min，TBST 洗涤3 次，用ECL 化学发光液显像，用Quantity One 凝胶软件测定各组蛋白条带灰度值，蛋白相对表达水平=目的条带灰度值/GAPDH 条带灰度值。每个蛋白样品设3 个重复。

1.2.4 MTT 试剂盒检测细胞活性

各组细胞培养至24、48、72 h 时分别加入20 μL 的MTT 溶液，37℃孵育4 h；每孔加入150 μL DMSO 后振荡反应15 min，酶标仪于490 nm 波长处检测各孔吸光度（OD）值。细胞活性（%）=实验组OD 值/空白对照组OD 值×100%。实验重复3次，每次设3 个复孔。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡

各组细胞培养48 h 后用PBS 漂洗2 次，重悬细胞，按照试剂盒说明书，先后加入Annexin V-FITC 和PI 避光孵育15 min，用流式细胞仪检测细胞凋亡。实验重复3 次，每次设3 个复孔。

1.2.6 酶联免疫吸附试验（ELISA）检测TNF-α、IL-1β、IL-6 含量水平

各组细胞培养至48 h 后离心取上清，具体按照按照ELISA 试剂盒说明书进行检测。

1.2.7 荧光素酶报告实验检测miR-374a-3p 对Syk 的靶向调控

构建Syk 野生型和突变型荧光素酶表达载体WT-Syk 和MUT-Syk，用LipofectamineTM2000 将WT-Syk和MUT-Syk分别与miR-NC和miR-374a-3p转染至细胞中。按照说明书要求，进行双荧光素酶报告实验检测。实验重复3 次。

1.2.8 统计学分析

采用SPSS 20.00 进行分析。计量资料以（）表示，两组比较行t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-374a-3p、Syk 在ox-LDL 作用的HUVEC中的表达

与对照组相比，ox-LDL 作用的HUVEC 中miR-374a-3p 表达水平显著降低，Syk 表达水平显著升高（P＜0.05）（图1，表1）。

图1 Syk 蛋白的表达Figure 1 Expression of Syk protein

表1 miR-374a-3p 在ox-LDL 作用的HUVEC 中的表达［n，（±s）］Table 1 Expression of miR-374a-3p in HUVECs treated with ox-LDL［n，（±s）］

表1 miR-374a-3p 在ox-LDL 作用的HUVEC 中的表达［n，（±s）］Table 1 Expression of miR-374a-3p in HUVECs treated with ox-LDL［n，（±s）］

注：与Con 组比较，a P＜0.05。

分组Con ox-LDL t 值P 值n9 9 miR-374a-3p 1.00±0.10 0.26±0.03a 21.264 0.000

2.2 过表达miR-374a-3p 对ox-LDL 作用的HUVEC 损伤及炎症反应的影响

与对照组相比，ox-LDL 作用的HUVEC 中miR-374a-3p 表达水平显著降低，Bax 表达水平显著升高，Bcl-2 表达水平显著降低，细胞活性显著降低，细胞凋亡率显著升高，TNF-α、IL-6 含量显著升高（P＜0.05）；与ox-LDL+miR-NC 组相比，ox-LDL+miR-374a-3p 组HUVEC 中miR-374a-3p 表达水平显著升高，Bax 表达水平显著降低，Bcl-2 表达水平显著升高，细胞活性显著升高，细胞凋亡率显著降低，TNF-α、IL-6 含量显著降低（P＜0.05）（图2，表2）。

图2 过表达miR-374a-3p 对ox-LDL 作用的HUVEC凋亡及凋亡蛋白表达的影响Figure 2 Effect of overexpression of mir-374a-3p on HUVEC apoptosis and expression of apoptotic protein by ox LDL

表2 过表达miR-374a-3p 对ox-LDL 作用的HUVEC 活性、凋亡及炎症反应的影响［n=9，（±s）］Table 2 Effect of overexpression of mir-374a-3p on HUVEC activity，apoptosis and inflammatory response induced by ox LDL［n=9，（±s）］

表2 过表达miR-374a-3p 对ox-LDL 作用的HUVEC 活性、凋亡及炎症反应的影响［n=9，（±s）］Table 2 Effect of overexpression of mir-374a-3p on HUVEC activity，apoptosis and inflammatory response induced by ox LDL［n=9，（±s）］

注：与Con 组比较，a P＜0.05；与ox-LDL+miR-NC 组比较，b P＜0.05。

分组Con ox-LDL ox-LDL+miR-NC ox-LDL+miR-374a-3p F 值P 值细胞活性（490 nm）24 h 0.61±0.06 0.24±0.02a 0.25±0.02 0.48±0.05b 171.304 0.000 48 h 0.98±0.10 0.37±0.04a 0.38±0.04 0.73±0.07b 173.503 0.000 72 h 1.46±0.15 0.56±0.05a 0.58±0.06 1.16±0.12b 165.433 0.000凋亡率7.52±0.83 26.61±2.74a 25.99±2.61 12.26±1.30b 201.728 0.000 miR-374a-3p 1.02±0.10 0.28±0.03a 0.27±0.03 0.81±0.08b 317.934 0.000 TNF-α 443.54±59.28 1762.27±156.61a 1705.68±161.28 686.53±75.82b 280.440 0.000 IL-6 75.51±11.58 415.69±38.89a 407.68±39.15 112.16±14.26b 360.902 0.000

2.3 miR-374a-3p 靶向、调控Syk

通过TargetScan 数据库预测到Syk 与miR-374a-3p 存在结合位点（图3A）。荧光素酶报告实验结果（表3）显示，相较于miR-NC 组，miR-374a-3p 组WT-Syk 的HUVEC 荧光素酶活性显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）；而MUT-Syk 的HUVEC 荧光素酶活性差异不显著，差异无统计学意义（P＞0.05）。Western Blot 检测结果（图3B）显示，相较于miR-NC 组，miR-374a-3p 组Syk 表达水平显著降低；而相较于anti-miR-NC 组，anti-miR-374a-3p组SykSyk 表达水平显著升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。可见，miR-374a-3p 靶向调控Syk。

图3 miR-374a-3p 靶向、调控SykFigure 3 mir-374a-3p targeting and regulating Syk

表3 双荧光素酶报告实验［n，（±s）］Table 3 Dual luciferase reporter experiment［n，（±s）］

表3 双荧光素酶报告实验［n，（±s）］Table 3 Dual luciferase reporter experiment［n，（±s）］

分组miR-NC miR-374a-3p t 值P 值n9 9 WT-Syk 1.04±0.10 0.31±0.03a 20.976 0.000 MUT-Syk 1.10±0.11 1.05±0.10 1.009 0.328

2.4 抑制Syk 对ox-LDL 作用的HUVEC 损伤及炎症反应的影响

与ox-LDL+si-N 组相比，ox-LDL+si-Syk 组HUVEC 中Syk、Bax 表达水平显著降低，Bcl-2 表达水平显著升高，细胞活性显著升高，细胞凋亡率显著降低，TNF-α、IL-6 含量显著降低（P＜0.05）（图4，表4）。

图4 抑制Syk 对ox-LDL 作用的HUVEC 凋亡及凋亡蛋白表达的影响Figure 4 Inhibition of Syk on HUVEC apoptosis and expression of apoptotic protein by ox LDL

2.5 过表达Syk 能逆转miR-374a-3p 对ox-LDL 作用的HUVEC 损伤及炎症反应的作用

与ox-LDL+miR-374a-3p+pcDNA3.1 组相比，ox-LDL+miR-374a-3p+pcDNA3.1-Syk 组HUVEC中miR-374a-3p 表达水平显著降低，Syk、Bax 表达水平显著升高，Bcl-2 表达水平显著降低，细胞活性显著降低，细胞凋亡率显著升高，TNF-α、IL-6 含量显著升高（P＜0.05）（图5，表5）。

表4 抑制Syk 对ox-LDL 作用的HUVEC 损伤及炎症反应的影响［n=9，（±s）］Table 4 Inhibition of Syk on HUVEC injury and inflammatory response induced by ox LDL［n=9，（±s）］

表4 抑制Syk 对ox-LDL 作用的HUVEC 损伤及炎症反应的影响［n=9，（±s）］Table 4 Inhibition of Syk on HUVEC injury and inflammatory response induced by ox LDL［n=9，（±s）］

注：与ox-LDL+si-NC 组比较，a P＜0.05。

分组ox-LDL+si-NC ox-LDL+si-Syk t 值P 值细胞活性（490 nm）24 h 0.26±0.02 0.42±0.04a 10.733 0.000 48 h 0.41±0.04 0.65±0.06a 9.985 0.000 72 h 0.63±0.06 1.04±0.10a 10.547 0.000凋亡率26.39±2.66 16.21±1.71a 9.658 0.000 TNF-α（pg/mL）1685.03±166.18 826.43±85.11a 13.796 0.000 IL-6（pg/mL）414.63±45.12 143.36±15.08a 17.106 0.000

图5 过表达Syk 能逆转miR-374a-3p 对ox-LDL 作用的HUVEC 凋亡及相关蛋白表达的影响Figure 5 Overexpression of Syk can reverse the effect of miR-374a-3p on apoptosis and related protein expression in HUVEC induced by ox-LDL

表5 过表达Syk 能逆转miR-374a-3p 对ox-LDL 作用的HUVEC 损伤及炎症反应的影响［n=9，（±s）］Table 5 Overexpression of Syk can reverse the effect of mir-374a-3p on HUVEC injury and inflammation induced by ox LDL［n=9，（±s）］

表5 过表达Syk 能逆转miR-374a-3p 对ox-LDL 作用的HUVEC 损伤及炎症反应的影响［n=9，（±s）］Table 5 Overexpression of Syk can reverse the effect of mir-374a-3p on HUVEC injury and inflammation induced by ox LDL［n=9，（±s）］

注：与ox-LDL+miR-NC 组比较，a P＜0.05；与ox-LDL+miR-374a-3p+pcDNA3.1 组比较，b P＜0.05。

分组ox-LDL+miR-NC ox-LDL+miR-374a-3p ox-LDL+miR-374a-3p+pcDNA3.1 ox-LDL+miR-374a-3p+pcDNA3.1-Syk F 值P 值细胞活性（490 nm）24 h 0.28±0.02 0.49±0.05a 0.51±0.05 0.36±0.03b 68.191 0.000 48 h 0.37±0.04 0.74±0.07a 0.76±0.07 0.53±0.05b 88.921 0.000 72 h 0.61±0.06 1.18±0.12a 1.20±0.12 0.78±0.08b 80.312 0.000凋亡率26.19±2.62 12.51±1.28a 12.63±1.30 21.20±2.24b 107.471 0.000 Sykm RNA 1.01±0.05 0.28±0.03 0.29±0.03 0.78±0.04 810.712 0.000 TNF-α（pg/mL）1695.65±168.21 691.13±74.83a 702.04±73.58 1431.23±151.00b 151.442 0.000 IL-6（pg/mL）413.28±40.05 115.06±13.76a 114.27±13.25 336.61±34.59b 267.969 0.000

3 讨论

内皮细胞损伤会导致炎性细胞浸润，引起炎症反应及一系列血管疾病，而炎症介质肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）又可降低HUVEC 的增殖活性，增加其凋亡率［8-9］，抑制内皮细胞损伤及炎症反应对相关疾病的防治具有重要意义。有研究发现苦参碱通过减少炎性因子表达、抑制氧化应激保护脂多糖诱导的HUVECs 损伤［10］。miR-21 过表达可降低HUVEC 内炎症因子TNF-α、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）的分泌，减轻ox-LDL诱导的HUVEC 炎症损伤［11］。本实验结果显示，ox-LDL 能诱导HUVEC 凋亡和炎症因子的释放。而过表达miR-374a-3p 后TNF-α、IL-1β、IL-6 含量降低，细胞凋亡率降低。还有研究报道miR-374a 可通过负调控MCP-1 的表达抑制糖尿病性肾病的炎症反应［12］。miR-374a-5p 过表达可减少氧/葡萄糖剥夺处理的PC12 细胞凋亡［13］。而本实验研究结果与其相一致，说明过表达miR-374a-3p 保护可保护ox-LDL诱导的HUVEC 损伤，减轻炎症反应。

研究报道干扰Syk 表达，caspase-3 活性和细胞凋亡显著降，保护缺氧/缺糖损伤诱导的神经元凋亡［14］。抑制Syk 还可降低脂多糖诱导的TNF-α 和IL-6 的释放，抑制炎症反应的发生［15］。本实验结果显示，ox-LDL 作用的HUVEC 中Syk 高表达，抑制Syk 表达后Bax 表达水平显著降低，Bcl-2 表达水平显著升高，细胞活性显著升高，细胞凋亡率显著降低，TNF-α、IL-6 含量显著降低。说明抑制Syk 表达可抑制HUVEC 凋亡和炎症反应，保护ox-LDL诱导的HUVEC 损伤。研究发现沉默miR-27a 通过激活Syk 依赖的mTOR 信号传导途径促进黑素瘤细胞的自噬和凋亡［16］。提示Syk 可被miRNA 调控进而影响细胞的凋亡。本实验结果显示，miR-374a-3p 可靶向调控Syk，过表达Syk逆转了miR-374a-3p 对ox-LDL 作用的HUVEC 损伤及炎症因子释放的抑制作用。表明，miR-374a-3p可能通过调控Syk 保护ox-LDL诱导的HUVEC损伤，减轻炎症反应。

综上所述，过表达miR-374a-3p 可抑制HUVEC凋亡和炎症因子的释放，保护ox-LDL 引起的HUVEC 损伤及炎症反应，其机制可能与Syk 有关。