长链非编码RNA 脑胞质RNA1在前列腺癌中的表达及作用机制

刘 明，陶思行，谭九峰，陈晓亮，晋学飞，王传芳，那万里

(1.四平市中心人民医院，吉林 四平136000；2.吉林大学中日联谊医院；3.榆树市中医院)

前列腺癌是男性常见恶性肿瘤之一，其发病率呈逐年上升趋势。前列腺癌早期症状不明显，大多数患者在初诊时已为中晚期，预后较差[1]。因此，提高前列腺癌的临床诊疗水平是十分必要的。长链非编码RNA(lncRNA)是一组转录本长度超过200nt、且不编码蛋白的RNA，其可在转录水平及转录后水平调控下游靶基因表达，并作为促癌基因或抑癌基因参与恶性肿瘤的发生与发展[2,3]。脑胞质RNA1(BCYRN1)是由人类染色体2p16编码的一类lncRNA[4]。研究证实，BCYRN1在非小细胞肺癌[5]、宫颈癌[6]等恶性肿瘤中表达失调，且其表达异常与肿瘤进展密切相关。但BCYRN1与前列腺癌的关系尚未明确。本研究旨在观察BCYRN1在前列腺癌中的表达及其与临床病理特征的相关性，并通过干预BCYRN1表达研究其对前列腺癌细胞凋亡的影响，以期为前列腺癌的临床诊疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 组织标本采集选取2018年1月至2018年12月我院行手术切除的47例前列腺癌患者癌组织样本和癌旁组织样本(距离肿瘤组织边缘>5 cm)，患者术前均未接受放化疗治疗。本研究经医院伦理学委员会审批通过，患者均签署知情同意书。

1.2 细胞系和主要试剂人前列腺正常肌成纤维基质细胞WPMY-1、前列腺癌细胞株PC-3、22RV1、DU-145、LNcap购于美国ATCC；DMEM培养基、PBS缓冲液、胰蛋白酶、胎牛血清购于Hyclone公司；RT-PCR试剂、Bax单抗、Bcl-2单抗、Akt单抗购于大连Takara公司；Western blot试剂盒购于南京建成生物有限公司；LipofectamineTM2000脂质体转染试剂购于Invitrogen公司；CCK8试剂盒购于碧云天试剂有限公司。

1.3 细胞培养与转染常规复苏细胞，用含有10%胎牛血清+1%双抗的DMEM培养液重悬浮细胞，并置于37℃、5% CO2培养箱中培养，每天换液1次。收集对数生长期的细胞，接种于细胞培养板中，细胞浓度为2×106cells/孔，采用LipofectamineTM2000用siRNA-NC、siRNA-BCYRN1对细胞进行转染，细胞置于37℃、5% CO2培养箱中培养24 h。

1.4 qRT-PCR检测BCYRN1表达参照Trizol试剂盒说明书提取组织/细胞中总RNA，利用反转录试剂盒逆转录总RNA至cDNA，以此cDNA为模板并根据SYBR Premix ExTaqTM说明书行qRT-PCR，用公式2-△△CT计算BCYRN1的相对表达。BCYRN1引物序列：上游5’-CTGGGCAATA-TAGCGAGAC-3’，下游5’-TGCTTTGAGGGAA-GTTACG-3’；GAPDH引物序列：上游5’-CGCTC-TCTGCTCCTCCTGTTC-3’，下游5’-ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC-3’。

1.5 BCYRN1表达与前列腺癌患者临床病理的关系根据BCYRN1的相对表达，将前列腺癌患者分为高表达组和低表达组，并分析BCYRN1表达与患者年龄、肿瘤大小、淋巴结转移、病理分级、T分期及Gleason评分的关系。

1.6 CCK-8检测细胞增殖收集转染后细胞，并接种于96孔板中，细胞终浓度为2×106cells/孔，分别于培养24 h、48 h、72 h、96 h时，弃去细胞培养液，每孔加入10 μl的CCK-8溶液，孵育10 min，用全自动酶标仪测定波长OD450 nm处光密度值。

1.7 流式细胞仪检测细胞凋亡收集转染后细胞，将细胞置于37℃、5% CO2条件中继续培养48 h，采用凋亡试剂盒(Annexin-V/PI)进行避光染色，1 h后上流式细胞仪检测细胞凋亡情况。细胞凋亡率=[(右上象限细胞+右下象限细胞)/总细胞数]×100%。

1.8 Western blot法检测凋亡相关蛋白表达收集转染后细胞，蛋白提取试剂盒提取细胞蛋白，BCA蛋白定量试剂盒检测样品蛋白浓度，取200 μl样品行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，4℃封闭4 h，后依次加入1∶2000浓度的Bcl-2、Bax、Akt、p-Akt 一抗(兔抗人Bcl-2和兔抗人Bax)、1∶500浓度HRP标记的二抗，按ECL试剂盒说明书行电化学发光检测。

1.9 统计学方法采用SPSS20.0分析数据，计量资料用均值±标准差(Mean±SD)表示，多组间比较用单因素方差检验，两两间比较用LSD-t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 BCYRN1在前列腺癌组织及细胞中的表达分析

BCYRN1在前列腺癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织(P<0.05)(见图1A)；与WPMY-1细胞比较，BCYRN1在PC-3、22RV1、DU-145、LNcap细胞中的表达明显增高(P<0.05)，其中以PC-3、22RV1细胞最高(见图1B)。

2.2 BCYRN1表达与前列腺癌患者临床病理的关系

BCYRN1高表达与前列腺癌患者病理分级、T分期及Gleason评分有关(P<0.05)，与患者年龄、肿瘤大小、淋巴结转移无关(P>0.05)(见表1)。

表1 BCYRN1表达与前列腺癌患者临床病理的关系

2.3 转染siRNA-BCYRN1对前列腺癌细胞中BCYRN1表达的影响

选取BCYRN1表达水平最高的两株前列腺癌细胞PC-3、22RV1为对象，并分别转染siRNA-NC和siRNA-BCYRN1，采用qRT-PCR检测细胞中BCYRN1表达。与转染siRNA-NC相比较，转染siRNA-BCYRN1后细胞中BCYRN1表达显著降低(P<0.05)(见图2)。

图1A 前列腺癌组织及癌旁组织中BCYRN1表达水平比较 图1B WPMY-1及前列腺癌细胞中BCYRN1表达水平比较 图2 转染siRNA-BCYRN1对前列腺癌细胞中BCYRN1表达的影响

2.4 转染siRNA-BCYRN1对前列腺癌细胞增殖的影响

CCK8结果显示：与转染siRNA-NC相比较，转染siRNA-BCYRN1后PC-3、22RV1细胞增殖活性均显著降低(P<0.05)(见图3A、3B)。

2.5 转染siRNA-BCYRN1对前列腺癌细胞凋亡的影响

流式结果显示：与转染siRNA-NC相比较，转染siRNA-BCYRN1后PC-3、22RV1细胞凋亡率均显著增高(P<0.05)(见图4)。

2.6 转染siRNA-BCYRN1对凋亡相关蛋白的影响

Western blot结果显示：与转染siRNA-NC相比较，转染siRNA-BCYRN1后PC-3、22RV1细胞Bcl-2、p-Akt表达显著减少(P<0.05)，Bax表达显著增高(P<0.05)，而Akt表达无明显变化(P>0.05)(见图5)。

图4 转染siRNA-BCYRN1对PC-3、22RV1细胞凋亡的影响

3 讨论

BCYRN1在多种恶性肿瘤中存在异常表达。Ren等[7]研究指出，BCYRN1在胃癌组织及胃癌细胞中均呈现高表达，且其表达与胃癌患者肿瘤大小及TNM分期呈正相关；沉默BCYRN1表达可明显抑制胃癌细胞体外增殖、迁移，并可诱导细胞G1/G0期阻滞，促进细胞凋亡。Booy等[8]研究表明，在乳腺癌细胞和肺癌细胞中均可见BCYRN1过表达，而BCYRN1表达下调可抑制癌细胞增殖，并诱导其凋亡。本研究中，我们通过观察前列腺癌组织和细胞系中BCYRN1表达变化发现，BCYRN1在前列腺癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织(P<0.05)，且前列腺癌细胞中BCYRN1表达均明显高于前列腺正常肌成纤维基质细胞(P<0.05)。进一步通过分析BCYRN1表达与前列腺癌临床病理特征的相关性发现，BCYRN1高表达与前列腺癌患者病理分级、T分期及Gleason评分有关(P<0.05)，但与患者年龄、肿瘤大小、淋巴结转移无关(P>0.05)。上述结果表明，BCYRN1在包括前列腺癌在内的多种恶性肿瘤中呈高表达，其表达上调可能参与了肿瘤的发生发展。

图5 转染siRNA-BCYRN1对PC-3、22RV1细胞凋亡相关蛋白表达的影响

之后，我们利用siRNA技术在前列腺癌细胞中实现了BCYRN1表达沉默，并以此分析BCYRN1在前列腺癌中的作用。结果发现：与转染siRNA-NC相比较，转染siRNA- BCYRN1可使得前列腺癌细胞中BCYRN1表达明显下调，同时显著抑制细胞增殖活性(P<0.05)，表明BCYRN1高表达是促使前列腺癌细胞恶性增殖主要原因之一。类似现象，也已在肺癌[9]、乳腺癌[10]中得到证实。此外，转染siRNA- BCYRN1前列腺癌细胞凋亡率明显增高，与转染siRNA-NC相比差异显著(P<0.05)，这表明BCYRN1可能是作为促癌基因参与前列腺癌的致瘤过程，并可调控前列腺癌细胞凋亡。

Akt信号通路位于细胞凋亡网络的上游，其过度激活是癌细胞得以存活的重要机制[11，12]。本研究中，我们检测了BCYRN1沉默后前列腺癌细胞中Akt的磷酸化水平，结果显示：转染siRNA- BCYRN1能够明显抑制前列腺癌细胞的Akt磷酸化，提示BCYRN1的促癌作用可能与调控Akt信号通路有关。Bcl-2、Bax是凋亡网络中的核心蛋白，其中Bcl-2具有抑制细胞凋亡作用，而Bax则可促进细胞凋亡[13，14]。当Bcl-2过度表达或Bax表达降低，则易形成Bcl-2/Bax异二聚体，从而抑制细胞凋亡；反之，当Bcl-2表达下调或Bax表达增高，则可形成Bax/Bax同二聚体，诱导细胞凋亡发生[12，15]。本研究结果显示，转染siRNA- BCYRN1后，随着前列腺癌细胞中Akt磷酸化水平的降低，其Bcl-2表达也显著减少(P<0.05)，而Bax表达则显著增高(P<0.05)。这表明，BCYRN1对前列腺癌细胞凋亡的调控机制，可能与激活Akt信号通路，进而调控Bcl-2/Bax表达有关。

综上所述，BCYRN1在前列腺癌组织和细胞中高表达，沉默BCYRN1可抑制前列腺癌细胞增殖，并促进细胞凋亡，其机制可能与调控Akt信号通路有关。