巨噬细胞在非酒精性脂肪性肝病中的作用

罗雨欣， 郭金波， 张晓岚

河北医科大学第二医院 消化内科， 石家庄 050000

据统计，全球非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)平均发病率高达25.2%，其中以中东和南美地区最高，分别为31.8%、30.4%[1-2]；我国脂肪性肝病的平均患病率约为16.5%[3]，甚至有研究调查显示上海地区成人NAFLD患病率高达43.65%[2]。因此，如何降低NAFLD的患病率及延缓或抑制其发病进程逐渐成为研究热点。

NAFLD的发病机制尚未完全阐明，目前认为“二次打击”甚至“多重打击”学说、肠道菌群紊乱、自噬、遗传等被认为是其主要发病机制。其中作为NAFLD经典发病机制的“二次打击”学说认为，在第二次打击中氧化应激及脂质过氧化等反应可激活肝脏组织内的固有免疫细胞，而巨噬细胞作为固有免疫重要的细胞群体之一，具有吞噬、抗原递呈和免疫调节等功能，在NAFLD的发病中起着至关重要的作用。既往研究主要单纯集中在NAFLD中氧化应激、炎症反应对巨噬细胞表型变化的影响，近年来对巨噬细胞的研究更加深入完善，包括脂肪组织巨噬细胞(adipose tissue macrophages，ATM)在NAFLD发生中可促进血液单核巨噬细胞向肝脏募集[4]；Nod样受体蛋白3 (Nod-like receptor protein 3，NLRP3)炎性小体激活后可促进NAFLD中巨噬细胞活化从而加速肝脏炎症反应[5]；NAFLD发生时不仅出现肠道菌群紊乱并且其产生的脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)可介导巨噬细胞CD14上调[6]，此外肠道菌群的代谢产物——棕榈酸也可募集巨噬细胞至肝脏[7]，从而加剧肝脏炎症反应等等。本文就巨噬细胞在NAFLD中的新近研究进展进行综述。

1 肝脏巨噬细胞的来源及其分类

肝脏中的巨噬细胞主要包括来源于胚胎早期卵黄囊时期祖细胞并在肝脏定居的巨噬细胞即枯否细胞，和来源于骨髓造血干细胞经血液循环募集至肝脏的单核巨噬细胞2大类。当肝细胞受损时，激活的枯否细胞可募集血液中单核细胞至肝脏，并向CD11b+F4/80+巨噬细胞即经典激活的M1型巨噬细胞分化，其可分泌TNFα、IL-1β、IL-6等促炎因子以及活性氧簇，加速肝脏组织损伤。同时这些巨噬细胞又可以分泌大量趋化因子，如C-C趋化因子配体(C-C chemokine ligand 2, CCL) 2、CCL3及CCL5等，募集血液循环中的单核巨噬细胞及T淋巴细胞进入肝脏，发挥其固有免疫及启动适应性免疫调节作用。另一方面，肝脏巨噬细胞的另一经典分型即替代激活的M2型巨噬细胞，在抑制炎症反应及组织修复过程发挥重要作用。当巨噬细胞受到IL-4、IL-13等细胞因子刺激后可向M2型极化，在分泌大量TGFβ、IL-10、IL-4及IL-13等抑制炎症因子的同时又可促进精氨酸酶活化从而使发挥促炎作用的M1型巨噬细胞凋亡，加速组织损伤修复和重塑。

2 巨噬细胞在NAFLD肝脏炎症中的作用

目前在人类试验和动物模型中均证实巨噬细胞参与了NAFLD进程中肝脏炎症反应。有研究[8]发现在人类肝脏单纯脂肪变阶段就存在门静脉区巨噬细胞的浸润，并且随着肝脏脂肪变和炎症程度的加重，肝脏中巨噬细胞数量也随之增加[9]，提示巨噬细胞可能参与了NAFLD的进程。在动物实验方面，有学者[10]证实了在NAFLD发病初期枯否细胞即可通过分泌TNFα等炎症因子启动肝脏炎症反应，并促进单核巨噬细胞向肝脏募集加重肝脏炎症反应；进一步应用三氯化钆清除巨噬细胞后，NAFLD大鼠的胰岛素抵抗明显改善，且肝脏脂肪变和炎细胞浸润减少[11]，证实在NAFLD中巨噬细胞起到了促进肝细胞脂肪变性和加速炎症反应的作用。

进一步分析NAFLD进程中巨噬细胞的表型变化，有学者[12]发现，在非酒精性脂肪性肝炎(NASH)患者中肝脏表达髓过氧化物酶的巨噬细胞数量较单纯脂肪变患者显著升高，同时肝脏中炎症因子IL-6、IL-8 mRNA的表达也明显增多；在动物实验中，应用蛋氨酸-胆碱缺乏饮食饲养小鼠4周后小鼠肝脏出现NASH改变，应用流式方法检测到肝脏巨噬细胞数量增加，并且无论是血清还是肝脏中促炎因子IL-12、iNOS等表达均到达高峰，提示起着促炎效应的M1型巨噬细胞在NAFLD发病前期发挥主要作用；随着饲养时间的延长，第8周时小鼠肝脏发生明显纤维化改变，同时巨噬细胞数量进一步增加且主要为M2型[13]，证实随着NAFLD进展、肝脏纤维化的产生，M2型巨噬细胞在促进肝脏组织修复、参与结构重建中起到主要作用。

3 巨噬细胞在NAFLD中的活化机制

3.1 ATM促进血液单核巨噬细胞向肝脏募集 脂肪组织不仅具有储存脂肪的功能，同时还是一个免疫器官。其中，ATM在NAFLD发病中起到了一定的作用。有研究[14]发现应用高脂高胆固醇饮食饲养小鼠构建NAFLD模型，在第6周时脂肪组织中巨噬细胞表面标志物F4/80及CCL2、CCL7等趋化因子的表达明显高于肝脏组织，随着饲养时间的延长，在16周及26周时肝脏组织中的巨噬细胞数量及TNFα、IL-1β等炎症因子的表达才开始增多，这意味着当NAFLD发生时，脂肪组织内巨噬细胞引起的炎症可能先于肝脏组织。不仅如此，Bijnen等[4]分别将肥胖小鼠和瘦型小鼠的ATM回输给喂养高脂饮食的小鼠，发现相比回输瘦型小鼠ATM，回输肥胖小鼠ATM的小鼠内脏脂肪组织中的巨噬细胞趋化因子表达显著增加，募集更多的中性粒细胞及巨噬细胞至肝脏，肝细胞损伤也更严重。同样，在严重肥胖NASH患者的内脏脂肪组织中也发现了主要表达在巨噬细胞和树突状细胞表面的促炎标志物CD11c的高表达，并且与肝脏组织活检髓过氧化物酶和CD11c的表达呈正相关[4]；进一步提取NASH患者的内脏脂肪组织的巨噬细胞进行体外培养，发现其上清液中TNFα、IL-6等炎症因子及CCL2较对照组明显升高[15]，证实ATM可以介导巨噬细胞、中性粒细胞等向肝脏趋化，加重肝脏炎症反应。

3.2 NLRP3炎性小体活化可激活肝脏巨噬细胞 NLRP3炎性小体是一种细胞内的模式识别受体，主要存在于巨噬细胞、树突状细胞及中性粒细胞，当其被激活时可分泌大量IL-1β、IL-18，导致炎症级联放大反应。近年来有学者指出，NLRP3在NAFLD发病中也发挥着重要作用。Mridha等[5]分别应用高脂和蛋氨酸-胆碱缺乏的饮食构建2种NASH小鼠模型，均发现NASH小鼠NLRP3炎性小体及IL-1β的表达明显升高，而应用NLRP3特异性抑制剂MCC950后，NASH小鼠肝脏组织中包括F4/80阳性细胞在内的炎性细胞浸润明显减少，IL-1β及CCL2的表达也显著降低；另外，有研究[16]应用髓系高表达NLRP3炎性小体的小鼠构建NASH模型，发现肝脏炎症以及IL-1β和TNFα等炎症因子的表达及肝细胞焦亡数量较野生型NASH小鼠明显增加；以上实验均证实NLRP3炎性小体可以增加NASH小鼠炎症因子及趋化因子的分泌，促进巨噬细胞向肝脏募集，加重肝脏炎症反应。进一步提取小鼠原代枯否细胞和骨髓来源的巨噬细胞并应用LPS活化后发现，已被证实存在于NASH患者和小鼠肝组织中的胆固醇结晶体能够激活巨噬细胞内NLRP3炎性小体，并且巨噬细胞培养液上清中IL-1β含量明显升高；另有研究[17]报道，胆汁酸中的鹅去氧胆酸也能够活化巨噬细胞内NLRP3炎性小体，增加IL-1β的分泌；然而对于敲除Toll样受体4和髓样分化因子88基因后的巨噬细胞培养液中IL-1β水平却无明显变化[6]，提示巨噬细胞内NLRP3炎性小体发挥作用可能需要二者的存在。

3.3 肠道菌群紊乱及其代谢产物影响肝脏巨噬细胞活化 2004年，Bäckhed等[18]发现无菌小鼠的体脂含量和肝脏甘油三酯水平明显降低，提示肠道菌群可能参与了肝脏脂质代谢，由此开启了肠道菌群对NAFLD影响的研究。有学者[19]给予小鼠蛋氨酸-胆碱缺乏饮食构建NASH模型，发现无论是饲养2周还是4周小鼠肠黏膜屏障均有不同程度的破坏，2周时另枝菌属和真菌属丰度明显下降，瘤胃球菌科UCG-014丰度上升，4周时双歧杆菌属丰度下降，而拟杆菌属丰度增加；同时粪便中的代谢组学特征也发生了明显变化，2周时花生酸、十六烷、棕榈酸及四十二烷改变最为明显，而4周时胆酸、胆固醇、花生酸及二十四烷改变最为显著，提示粪便中代谢产物的变化可以作为NAFLD进程的潜在生物标志物。

目前数据表明，肠道菌群来源的病原相关分子模式不仅可激活肠道内的固有免疫系统，同时也激活了肝脏巨噬细胞，加重肝脏炎症反应，从而促进NASH的发展。有学者[7]发现NASH小鼠体内注射低剂量的LPS后，可加重肝脏脂肪变性和纤维化，同时CD14阳性的巨噬细胞数量增加，而进一步将CD14沉默后，小鼠则表现为ALT和TNFα、IL-6表达下降，提示LPS可能通过介导巨噬细胞CD14上调，导致促炎因子释放增加，同时这些促炎因子又可导致肝细胞内脂质蓄积，从而加剧NASH。另外，肠道菌群作为一个“消化器官”，可产生大量的代谢产物，其中饱和脂肪酸便是其中一种。Yamada等[7]研究发现，肠道微生物群产生的一种长链饱和脂肪酸-棕榈酸可以促进CCL2分泌增加，导致肝脏内巨噬细胞数量明显增多，加重高脂肪饮食诱导的小鼠脂肪性肝炎，而清除肠道菌群后这种改变会被逆转；提示肠道菌群的某些代谢产物可以通过巨噬细胞影响NAFLD的进程。

4 靶向巨噬细胞药物在NAFLD中的应用

总的来说，巨噬细胞在NAFLD中的作用比较明确，在发病初期主要是通过M1型巨噬细胞分泌一系列促炎因子以及趋化因子，加重肝脏的炎症反应，而随着病程的发展转为M2型巨噬细胞，在抑制炎症、促进肝纤维化方面起主要作用。因而，针对巨噬细胞设计干预药物治疗NAFLD已成为研究热点。根据巨噬细胞在NAFLD发病中的作用机制，目前有两大类靶向药物，包括直接靶向巨噬细胞药物和间接靶向巨噬细胞药物。

4.1 直接靶向巨噬细胞药物 直接靶向巨噬细胞治疗NAFLD药物主要包括以下三类：(1)抗CD163药物。有学者[20]发现巨噬细胞表面具有糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor, GR)，且具有肥胖基因的高脂饮食小鼠GR表达量明显低于野生型小鼠，而经高脂饮食饲养24周的巨噬细胞特异性缺乏GR小鼠较野生型小鼠肝脏组织CCL2、IL-6 mRNA水平明显升高，提示糖皮质激素可能成为治疗NASH的新方案。为此，Svendsen 等[21]便应用低剂量地塞米松治疗高果糖诱导的大鼠NASH模型，发现其可明显改善肝脏组织炎症及纤维化，并且肝脏及血清中脂质及TNFα、IL-1β水平也显著降低，同时大鼠并未表现出严重的不良反应，这就为日后低剂量糖皮质激素有可能应用于临床治疗NAFLD患者打下了基础。(2)抗C-C趋化因子受体2 (C-C chemokine receptor 2, CCR2)/CCR5药物。代表药物Cenicriviroc是一种可口服的CCR2/CCR5双重拮抗剂，可以抑制单核巨噬细胞向肝脏募集。有研究[22]发现，给予高脂饮食诱导的NASH小鼠Cenicriviroc后，不仅能显著降低血清ALT水平，并且纤维化明显逆转，但肝脏组织的炎症及巨噬细胞的数量和极化分型无明显变化；但在西方饮食和蛋氨酸-胆碱缺乏饮食诱导的NASH小鼠模型中发现Cenicriviroc能够减少巨噬细胞向肝脏募集，减轻肝脏炎症及纤维化[23]。有Ⅱ期临床试验[24]共纳入289例NASH患者，患者接受Cenicriviroc治疗1年后，肝纤维化程度较安慰剂组明显改善，但肝脏脂肪变及炎症无明显改变。(3)半乳凝素(galectin, Gal)-3阻断剂。Gal-3是一种与糖蛋白末端半乳糖残基结合的蛋白质，主要表达于巨噬细胞，其早已被证实对肝纤维化具有促进作用，但对NASH的作用有争议。有学者[25]认为Gal-3可促进高脂饮食诱导的NASH小鼠肝脏脂质聚积、炎细胞浸润及肝纤维化；也有学者[26]发现在胆碱缺乏饲料诱导的NASH小鼠模型中Gal-3具有保护作用。最近一项研究[27]则指出，Gal-3可抑制NASH小鼠肝脏脂肪变，但能促进炎症、肝细胞损伤和肝纤维化。GR-MD-02是一类Gal-3抑制剂，有研究[28]应用其治疗高脂饮食诱导的NASH小鼠，发现不仅NAFLD活动积分明显降低，甚至肝纤维化也显著逆转，同时肝脏巨噬细胞的Gal-3表达也明显下降；不仅如此，目前已完成GR-MD-02治疗经肝组织活检证实的NASH患者的Ⅰ期临床试验，受试者对GR-MD-02均有较好的耐受性，且无不良反应，并且高剂量组具有一定的改善肝纤维化的效果[29]；目前已经开展了临床Ⅱ期试验，结果可拭目以待。以上实验/试验均表明，这些药物可能会成为很有前景的NAFLD治疗方案(表1)。

4.2 间接靶向巨噬细胞药物 间接靶向巨噬细胞药物不直接针对巨噬细胞，但可作用于NAFLD发病过程中不同的通路，间接影响巨噬细胞的功能，主要包括以下几类：(1)法尼醇X受体(farnesoid receptor, FXR)激动剂。代表药物为奥贝胆酸，Yao 等[30]应用高脂饮食诱导构建NAFLD小鼠模型，并应用LPS激发肝脏炎症，发现应用FXR激动剂GW4064可减少肝脏中炎性细胞的浸润以及巨噬细胞的数量，进一步在体外对小鼠巨噬细胞系RAW 264.7进行干预，发现IL-6、IL-1β和CCL2的表达也显著下降；并且在NASH患者中发现随着NAS评分的升高肝组织中的FXR表达也随之下降。2015年的Ⅱb期临床试验[31]证实其对NAFLD患者除了能够调节肝脏糖脂代谢，还具有抗炎抗纤维化作用；提示FXR激动剂可能部分作用于肝脏巨噬细胞来延缓NASH的发展。(2)胰高血糖素样肽-1受体激动剂(glucagon-like peptide-1 receptor agonists, GLP1RA)。Exendin-4作为一种GLP1RA已被证实在NAFLD小鼠中会抑制CCL2的表达以及减少巨噬细胞在肝脏中的浸润，并减弱巨噬细胞对氧化低密度脂蛋白的摄取，减少胆固醇在巨噬细胞内的沉积[32]。目前另一个代表药物利拉鲁肽已进入临床试验研究，证实其可以改善NAFLD患者肝组织脂肪变及纤维化程度[33]。(3)伊马替尼。它为一种酪氨酸激酶抑制剂，有学者研究证实应用伊马替尼干预M1型腹膜巨噬细胞可以抑制TNFα、IL-6和IL-1β等促炎基因的表达，同时培养液上清中TNFα和IL-6水平明显下降，相反，在M0型和M2型腹腔巨噬细胞中这些促炎基因表达无明显变化；进一步构建高脂饮食小鼠NASH模型，发现应用伊马替尼3个月的小鼠肝组织中巨噬细胞数量明显减少并且TNFα表达也显著降低，提示伊马替尼会减少巨噬细胞向肝脏募集并抑制巨噬细胞向M1型极化[34]。(4)过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor, PPAR) γ激动剂——吡格列酮、PPARα/δ激动剂——Elafibranor、磷酸二酯酶(phosphodiesterase, PDE)抑制剂——Pentoxifylline、细胞凋亡信号调节激酶1(apoptotic signal-regulating kinase 1, ASK1)抑制剂——Selonsertib等药物均在NAFLD中间接影响巨噬细胞发挥抗炎作用(表2)。

5 小结

目前为止，在NAFLD发病中关于巨噬细胞如何活化、募集至肝脏的作用机制已经取得一定进展，包括巨噬细胞极化分型、ATM、巨噬细胞内NLRP3炎性小体的激活、肠道菌群及其代谢产物对巨噬细胞的影响等方面，为NAFLD的治疗提供了新思路，但目前针对直接巨噬细胞治疗NAFLD的靶向药物目前大多在基础研究中显示有效，而临床还未有应用或尚未完成Ⅳ期临床试验，需进一步深入研究。

表1 直接靶向巨噬细胞药物分类及其作用

表2 间接靶向巨噬细胞药物分类及其作用