大鼠骨髓间质干细胞免疫原性观察

梁爽 张贵育 孔杰

【摘要】 目的 探讨骨髓间质干细胞的免疫原性， 评估骨髓间质干细胞活化免疫系统的能力。

方法 分离培养大鼠股骨中的骨髓间质干细胞， 扩增后分别经体外细胞刺激实验和体内移植后评估两个方面来评价大鼠骨髓间质干细胞的免疫原性。体外实验采用淋巴细胞激活实验进行， 体内实验将骨髓间质干细胞经静脉移植到大鼠体内， 观察移植后大鼠的脾脏指数， 并解剖大鼠， 了解骨髓间质干细胞的致瘤性。结果 大鼠骨髓间质干细胞在体外增殖能力强， 反复传代至10代以后， 仍能良好生长， 且生物学特征无明显变化。各组在加入CCK-8试剂终止反应后用酶标检测仪测得的结果显示：观察组为（1.515±0.737）， 阳性对照组为（1.966±0.421）， 阴性对照组为（1.302±0.259）， 三组比较差异具有统计学意义（P<0.05）， 观察组与阳性对照组比较差异具有统计学意义（P<0.05）， 阴性对照组与观察组比较差异无统计学意义（P>0.05）。细胞移植后， 外源性骨髓间质干细胞进入大鼠血液系统， 具有直接活化免疫系统的条件;同时随着循环系统迁移， 向全身播散;在移植后不同时间点解剖大鼠， 仔細观察各内脏器官、脑组织和骨骼肌， 组织形态基本正常， 未发现肿瘤形成。细胞移植后第8周处死大鼠， 解剖分离脾脏， 计算脾脏指数， 结果显示， 实验组大鼠脾脏指数（58.7±12.4）与对照组的（57.3±21.5）比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论 骨髓间质干细胞在体外共培养体系中不能活化淋巴细胞， 经静脉移植后在体内也不能上调宿主的免疫状态， 且无明显致瘤性， 是用于细胞移植治疗的良好种子细胞。

【关键词】 骨髓间质干细胞;免疫原性;细胞移植

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.02.088

Immunogenicity of bone marrow mesenchymal stem cells in rats   LIANG Shuang， ZHANG Gui-yu， KONG Jie. Shenzhen Baoan Hospital of Traditional Chinese Medicine， Shenzhen 518133， China

【Abstract】 Objective   To investigate the immunogenicity of bone marrow mesenchymal stem cells and evaluate their ability to activate the immune system. Methods   Bone marrow mesenchymal stem cells were isolated and cultured in vitro. After amplification， the immunogenicity of bone marrow mesenchymal stem cells was evaluated from both in vitro and in vivo. In vitro experiments were carried out using lymphocyte activation assay， and in vivo experiments were performed by transplanting bone marrow mesenchymal stem cells into rats. The spleen index of the transplanted rats was observed， and the rats were dissected to understand the tumorigenicity of bone marrow mesenchymal stem cells. Results   The proliferation ability of bone marrow mesenchymal stem cells in rats is strong in vitro， and they can grow well after 10 generations， and there is no obvious change in biological characteristics. After the termination of reaction with CCK-8 reagent， the results measured by enzyme-linked detector in each group showed that： the observation group was （1.515±0.737）， the positive control group was （1.966±0.421）， the negative control group was （1.302±0.259）， and the difference was statistically significant significant among the three groups （P<0.05）. The observation group and the positive control group had statistically significant difference （P<0.05）， and the negative control group and the observation group had statistically significant difference （P<0.05）. After cell transplantation， the exogenous mesenchymal stem cells entered the blood system of rats， which had the conditions of activating the immune system directly; at the same time， they spread to the whole body with the circulation system migration; after transplantation， the rats were dissected at different time points， and the visceral organs， brain tissues and skeletal muscles were observed carefully. Their tissue morphology was basically normal， and no tumor was found. The rats were killed at 8 weeks after cell transplantation， the spleen was dissected and the spleen index was calculated. The results showed that the spleen index of the experimental group （58.7±12.4） was not significantly different from that of the control group （57.3±21.5） （P>0.05）. Conclusion   Bone marrow mesenchymal stem cells cannot effectively activate lymphocyte cell in vitro， and it does not significantly up-regulate the host's immune status in vivo， and has no obvious tumorigenic performance. It is a good seed cell selection for cell transplantation therapy.

【Key words】 Bone marrow mesenchymal stem cells; Immunogenicity; Cell transplantation

骨髓间质干细胞是存在于骨髓中具有向多个胚层细胞分化能力的干细胞， 在体外能够大量复制扩增， 既往研究证实， 骨髓间质干细胞可分化表达多种细胞表型。正是因骨髓间质干细胞具备自我复制扩增和向多个胚层细胞分化的特点， 现已广泛应用于多种疾病的研究[1， 2]。其中一个重要的研究方向就是利用骨髓间质干细胞作为种子细胞来移植治疗多种疾病[3]。而种子细胞的免疫原性是移植能否成功的重要因素之一。本研究在体外分离培养来源于大鼠的骨髓间质干细胞， 观察其生物学特性演变并进行同种异体的细胞移植， 探索骨髓间质干细胞的免疫原性。现报告如下。

1 材料与方法

1. 1 SD大鼠骨髓间质干细胞的分离和扩增 雄性SD大鼠， 体重约150 g， 处死后用75%的酒精进行消毒， 时间为10 min，

无菌条件下快速解剖分离出双侧后肢股骨， 剪开股骨两侧头部， 用DMEM-F12培养液冲洗骨髓腔， 收集骨髓冲洗液， 经离心（1200 r/min） 5 min后收集细胞， 含10%胎牛血清的DMEM-F12培养液重悬， 重悬液经100目滤网过滤后接种于培养瓶， 置于37℃、5% CO2培养箱中培养， 24 h后更换培养液， 每3～4天更换培养液1次， 待細胞生长融合， 铺满培养瓶底部后， 用2.5 g/L的胰蛋白酶消化后按1∶2进行传代培养。

1. 2 体外淋巴细胞增殖实验

1. 2. 1 淋巴细胞分离 取健康人外周血约3 ml（肝素抗凝）， 用Percoll淋巴细胞分离液分离出淋巴细胞。

1. 2. 2 刺激细胞的制备 取第5代骨髓间质干细胞， 生长至约80%汇合时， 用胰蛋白酶消化， 离心后用含20%小牛血清的1640培养液调整细胞浓度为5×105/ml。

1. 2. 3 单向混合淋巴细胞反应 为了确定骨髓间质干细胞是否具有刺激人的外周血淋巴细胞增殖的作用， 将分离的外周血淋巴细胞和骨髓间质干细胞按1∶1混合， 进行淋巴细胞增殖实验。设立阳性对照组和阴性对照组， 具体如下：阴性对照组为人外周血淋巴细胞;阳性对照组为人外周血淋巴细胞和植物血细胞凝集素（PHA）（100 mg/L， 20 μl/孔）混合培养组;观察组为人外周血淋巴细胞和大鼠骨髓间质干细胞混合培养。实验体系在96孔培养板中进行， 每组设3个复孔， 每孔接种细胞数为1×104个。96孔板接种细胞后置于37℃、5%CO2环境中培养2 d加入CCK-8 （10 μl/孔）， 混匀后孵育4 h后用酶标仪检测吸光度值。

1. 3 经尾静脉移植大鼠骨髓间质干细胞 取第五代细胞， 常规消化离心收集细胞;培养液重悬锥虫蓝染色后镜下计数细胞后重悬。实验组大鼠固定后经尾静脉缓慢注射0.5 ml的细胞悬液， 移植细胞总数约为2×107/只， 对照组大鼠经尾静脉注入等体积生理盐水。

1. 4 移植后大鼠脾脏指数及各器官的致瘤性观察 分别在细胞移植后第4、8、16周处死大鼠， 解剖大体器官， 观察器官形态结构有无异常， 是否出现肿瘤。

用于脾脏指数观察的大鼠选择细胞移植后第8周大鼠， 沿腹中线剖开腹腔， 剥离脾脏， 尽可能将脾脏上的脂肪完全清除后称重。计算每只大鼠的脾脏指数。计算公式：脾脏指数 =脾脏重量（mg）/大鼠体重（g）×10。

1. 5 统计学方法 采用SPSS23.0统计学软件对数据进行处理。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验， 多组比较采用方差分析;计数资料以率（%）表示， 采用χ2检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2. 1 体外培养的大鼠骨髓间质干细胞生物学特性 骨髓腔冲洗液接种培养瓶后可见大多数为悬浮细胞， 培养1 d后部分圆形细胞呈现贴壁生长， 培养2 d后更换培养液， 可见贴壁生长的细胞逐渐向梭形演化， 培养5 d后大部分细胞外观呈成纤维细胞样表现。继续培养10 d后多数细胞为长梭形， 形成致密生长层。传代培养后， 细胞生长速度明显增快， 约3、4 d即可进行传代培养（图1）。大鼠骨髓间质干细胞在体外增殖能力强， 反复传代至10代以后， 仍能良好生长， 且生物学特征无明显变化。

2. 2 体外淋巴细胞增殖试验结果 各组在加入CCK-8试剂终止反应后用酶标检测仪测得的结果显示：观察组为（1.515±0.737）， 阳性对照组为（1.966±0.421）， 阴性对照组为（1.302±0.259）， 三组比较差异具有统计学意义（P<0.05）， 观察组与阳性对照组比较差异具有统计学意义（P<0.05）， 阴性对照组与观察组比较差异无统计学意义（P>0.05）。

2. 3 细胞移植后成瘤性观察 细胞移植后， 外源性骨髓间质干细胞进入大鼠血液系统， 具有直接活化免疫系统的条件;同时随着循环系统迁移向全身播散;在移植后不同时间点解剖大鼠， 仔细观察各内脏器官、脑组织和骨骼肌， 组织形态基本正常， 未发现肿瘤形成。

2. 4 细胞移植对大鼠脾脏指数的影响 细胞移植后第8周处死大鼠， 解剖分离脾脏， 计算脾脏指数， 结果显示， 实验组大鼠脾脏指数（58.7±12.4）与对照组的（57.3±21.5）比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

3 讨论

干细胞移植已经成为很多难治性疾病有希望的治愈方法之一， 目前已经成为医院的研究热点。外源性干细胞移植能否成功的因素有很多， 其中外源性细胞免疫原性引起的免疫排斥反应和致瘤性是重要的影响因素[4]。因此， 对种子细胞的选择至少应该具备2个特性：①免疫原性低， 不刺激宿主产生较强的免疫排斥;②不能造成外源性肿瘤发生。

[8] Zheng YH， Xiong B， Deng YY， et al. Effects of allogeneic bone marrow mesenchymal stem cells on polarization of peritoneal macrophages in rats with sepsis. Chinese journal of burns， 2017， 33（4）：217-223.

[9] Yamakawa J， Hashimoto J， Takano M， et al. The boneregeneration using bone marrow stromal cells with moderate concentration platelet-rich plasma in femoral segmental defect of rats. Open Orthop J， 2017（11）：1-11.

[10] Xu GS， Liu K， Anderson J， et al. Expression of XBP1s in bone marrow stromal cells is critical for myeloma cell growth and osteoclast formation. Blood， 2012， 119（18）：4205-4214.

[11] Zhou J， Jiang LY， Long X， et al. Bonemarrowderived mesenchymal stem cells inhibit gastric aspiration lung injury and inflammation in rats. J Cell Mol Med， 2016， 20（9）：1706-1717.

[12] Mohammadis， Nikbakht M， Sajjadi SM， et al. Reciprocal interactions of leukemic cells with bone marrow stromal cells promote enrichment of leukemic stell cell compartments in response to curcumin and daunorubicin. Asian Pac J Cancer Prev， 2017， 18（3）：831-840.

[收稿日期：2019-08-09]