早期自然流产绒毛染色体检查与相关遗传咨询的关系

郭丽娜，廖英，刘盼，田瑜，赵敏英，苏雅琴

研究发现，胚胎染色体异常是导致自然流产发生的主要原因，在全部引起自然流产的主要原因中约占50%[1]。绒毛是胚胎组织重要的组成部分，其遗传性状与胚胎组织相同，故绒毛细胞制备染色体核型可直接作为胎儿染色体核型[2]。目前，主要的绒毛染色体异常检查技术有核型分析、荧光原位杂交（FISH）、高通量测序，其中核型分析是目前公认的染色体异常检查金标准，可检测染色体数目异常、5～10 Mb以上结构异常[3]。但该技术仍存在很大局限。FISH的使用与“金标准”相比，对样本要求较低，可不进行细胞培养，但无法覆盖整个染色体组[4]。高通量测序以高准确性、快速、高敏感度等优势打破了既往研究中的通量限制，是广泛用于临床的新型技术[5]。本研究回顾性分析这三种技术检测妊娠早期自然流产患者绒毛染色体异常率，旨在为未来绒毛染色体异常检测技术的选择提供依据。同时随访检测成功的患者的遗传咨询情况及后续妊娠情况，分析遗传咨询对再次妊娠的影响。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集2017年1月—2019年1月因早期自然流产于石家庄市第一医院（我院）就诊的行绒毛染色体检查的患者。纳入标准：符合《妇产科学》[6]中自然流产的诊断标准，即流产时孕周≤12周，年龄范围20～45岁。排除标准：有妊娠期并发症患者；不同意签署知情同意书的患者；合并精神疾患或心理疾患等可能在研究中发病导致配合度低下者；有良性肿瘤疾病或恶性肿瘤疾病的患者；合并重要脏器功能不全者。研究最终纳入患者100例，年龄21～42岁，平均（30.02±4.11）岁；体质量44～75 kg，平均（58.24±5.21）kg；孕次1～7次，平均（3.51±1.11）次；流产次数1～6次，平均（3.10±1.10）次；产次1～3次，平均（1.50±0.50）次。本研究已获得我院医学伦理委员会批准，纳入的患者均签署了知情同意书。后续对检测成功的病例进行遗传咨询等随访。

1.2 研究方法 收集所有患者的流产绒毛样本，其中核型分析检测17例，FISH检测11例，高通量测序72例。FISH DNA探针购自北京必莱格生物科技有限公司，规模型号：18、X、Y染色体特异性着色粒探针，13、21染色体位点特异性探针，16、22染色体位点特异性探针。杂交缓冲液、DAPI复染剂、20×SSC干粉、甲酰胺购自北京金菩嘉医疗科技有限公司，BX荧光显微镜购自日本Olympus公司，FISH2.0图像处理系统购自Video Text公司，Hiseq2500型测序仪器平台购自美国Illumina公司。各检测均严格按照说明书操作。

1.3 统计学方法 应用SPSS20.0统计学软件进行统计学分析。定性资料用例数（百分率）表示，n≥40且T＞5，使用卡方检验；n≥40且1＜T≤5，用连续校正检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 整体检出结果 最终成功检测88例（88.00%），共检出染色体异常者45例（51.14%），其中主要为常染色体异常，且以染色体数目异常较常见。见表1。

表1 45例染色体异常检出结果分布构成 （N=45）

2.2 绒毛染色体结果 核型分析技术检测成功率为76.47%（13/17），异常核型检出率为46.15%（6/13）。检出的异常染色体核型主要涉及2、3、4、8、13号常染色体和性染色体。FISH技术检测成功率为100.00%（11/11）。检出异常核型4份，均为染色体数目异常，分别为21-三体、18-三体、16-三体、45,X各1例，异常核型检出率为36.36%（4/11）。高通量测序技术检测成功率为88.89%（64/72）。检出异常核型35份，异常核型检出率为54.69%（35/64）。染色体异常主要涉及3、5、6、8、9、11、14、15、16、18、22号常染色体和性染色体。三种检测技术检测成功率、异常核型检出率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

2.3 对成功检测流产绒毛染色体患者的随访 随访成功率57.95%（51/88），其中包括流产绒毛染色体异常的患者32例，流产绒毛染色体正常的患者19例。51例患者中年龄≥35岁者流产绒毛染色体正常7例（25.00%），异常21例（75.00%）；＜35岁患者检出染色体正常12例（52.17%）、异常11例（47.83%）。二者绒毛染色体异常比例差异有统计学意义（χ2=3.898，P=0.044）。孕周＜8周的患者检出绒毛染色体正常者11例（55.00%）、异常9例（45.00%）；孕8～12周患者分别检出染色体正常者8例（25.81%）、异常23例（74.19%）。二者染色体异常比例差异有统计学意义（χ2=4.432，P=0.035）。

2.4 绒毛染色体异常患者的遗传咨询情况 流产绒毛染色体异常的患者共45例，成功随访率71.11%（32/45）。进行遗传咨询患者的再次妊娠结局优于未进行遗传咨询的患者，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。16例进行遗传咨询后正常妊娠的患者中，有1次流产史者2例，均为绒毛染色体数目异常，后均正常自然妊娠。流产史≥2次者14例，其中8例通过胚胎植入前染色体筛查正常妊娠，8例中绒毛染色体数目异常6例，绒毛染色体结构异常2例（1例平衡易位，1例染色体微缺失）；其余6例正常自然妊娠，均为绒毛染色体数目异常。这14例患者均追查了夫妇双方染色体，除1例绒毛染色体结构异常的患者男方存在染色体结构异常外，其余夫妇双方染色体均正常。4例进行遗传咨询后再次流产的患者中有1次流产史者1例，为绒毛染色体数目异常，再次自然妊娠流产；有≥2次流产史者3例，均为绒毛染色体数目异常，均为自然妊娠后流产。2例进行遗传咨询后未孕的患者均为染色体数目异常，患者暂无再次妊娠计划。未做遗传咨询正常妊娠的患者2例，均有1次流产史，再次妊娠均为自然妊娠。未做遗传咨询再次流产的患者7例，有1次流产史者3例，均为绒毛染色体数目异常，均为自然妊娠流产；有≥2次流产史者4例，绒毛染色体数目异常3例，绒毛染色体结构异常1例（染色体微重复），均为自然妊娠流产。未做遗传咨询的患者未孕者1例，为绒毛染色体数目异常，患者为上次流产后1年半正常性生活未避孕未孕。

表2 三种检测技术检测成功率、异常核型检出率比较

表3 发现绒毛染色体异常后遗传咨询对再次妊娠结局的影响 [例（%）]

3 讨论

早期自然流产是一种病理妊娠，患病率约为10%～20%。现有的研究认为，妊娠早期自然流产发生与诸多因素有关，其中胚胎染色体异常是其独立危险因素。染色体异常主要包括染色体数目异常和结构异常。染色体数目异常是最为常见的染色体异常类型，会导致基因组严重失调，从而影响胚胎的生长与发育。本研究结果显示，成功检测的88份妊娠早期流产胚胎绒毛样本中，共检出45份染色体数目异常，检出率为51.14%，其中染色体数目异常34份，占总异常的75.56%（35/45），与目前相关研究结果基本相似[7]。染色体结构异常包括染色体倒位、易位、重复、缺失等，相较于染色体数目异常检出率较低，约占3%～5%。此外需注意基因异常，临床上常见的基因异常包括单亲二倍体与单基因突变，这些异常即便是经核型分析技术或FISH技术也无法有效检出，极易造成漏诊。本研究35份经高通量测序检出异常核型的绒毛样本中，检出1份单亲二倍体，推测高通量测序技术的应用在此种异常中可能较其他两种方法更具价值。

染色体核型分析技术能排查大部分的染色体异常情况，是染色体核型检测的主要手段。但其有对样本要求高，检测周期长，对技术和人员要求较高，只能观察5～10 Mb以上结构异常，难发现微重复及微缺失等局限，限制其临床使用[8]。

FISH技术是建立在碱基互补配对基础上，目前广泛用于细胞遗传学与分析生物学中。与染色体核型分析技术相比，FISH技术具有如下优势：不需进行细胞培养；可用于全部分裂周期各阶段染色体检测；检测时间短等。何天文等[9]研究结果显示，利用FISH技术检测607例妊娠早期流产绒毛组织，检测成功率为100%，异常核型检出率为41.69%，在成功率方面与本研究结果一致，但异常核型检出率高于本研究，究其原因可能与本研究纳入样本量较少有关。应注意，FISH技术仅能检测已知染色体非整倍体异常，无法测定结构异常[10]。

高通量测序技术是二代测序技术，以高通量、高准确性、高灵敏度等优势广泛用于医学诊断领域。全基因组低覆盖测序能够测定染色体数目与结构异常、200 kb以上染色体片段的微缺失及微重复等。相较于核型分析技术拥有更高的分辨率，可以扫描整个染色体微重复或微缺失[11]。本研究结果显示，3种检测技术检测成功率、异常核型检出率比较均无统计学意义（P＞0.05），这可能与纳入样本量较少有关，但仍不难发现此技术在早期自然流产绒毛染色体异常检测中的应用价值。值得注意的是，高通量测序技术无法检测平衡易位和多倍体。该结果提示临床，实际检查中应综合各技术的优缺点，必要时各技术结合检测，以提高检测成功率与异常核型检出率。

遗传咨询贯穿于整个遗传检测的过程，也是连接下一步诊疗和预防的必要环节[12]。检出染色体异常后，建议进行遗传咨询指导再次妊娠。本研究发现在随访的51例患者中，进行遗传咨询患者的再次妊娠结局优于未进行遗传咨询的患者。本研究发现在染色体异常中，以染色体数目异常居多，其中以三体居多。据报道常染色体数目异常主要以新发为主，多是为配子减数分裂过程中染色体不分离所致[13]。此时，若夫妇双方染色体正常，排除其他因素影响后，可在指导下尝试自然妊娠。但是对于有≥2次流产史的患者，建议追查夫妇双方染色体，可选择胚胎植入前染色体筛查。本研究随访的14例有≥2次流产史的患者中，6例是绒毛染色体数目异常，夫妇双方染色体均正常，遗传咨询后选择胚胎植入前染色体筛查受孕。染色体结构异常主要以新发为主，家族性染色体结构异常的再发风险约为10%～15%[14]。因此对于流产绒毛染色体结构异常的患者，有必要追查夫妇双方染色体，确定绒毛染色体异常的遗传来源，对再次受孕进行指导，以降低再次流产的发生率。本研究随访中共有3例绒毛染色体结构异常的患者，其中2例追查了夫妇双方染色体，其中1例存在父亲染色体异常，遗传咨询后2例均选择胚胎植入前染色体筛查成功正常妊娠；另外1例未查夫妇双方染色体也未进行遗传咨询，再次妊娠结局仍是自然流产。

本研究随访发现≥35岁的早期自然流产患者的绒毛染色体异常明显高于35岁以下的患者。有研究报道，≥35岁孕妇绒毛染色体异常核型风险增高[15]。因此，对于≥35岁高龄流产者，若曾有流产绒毛染色体异常，建议追查夫妇双方染色体后进行遗传咨询，视具体情况可选择胚胎植入前染色体筛查，防止再次流产发生。本研究随访还发现孕8～12周流产者的绒毛染色体异常检出率明显高于孕不足8周流产者，这与研究报道一致[16]，提示孕45 d左右B超检查正常后不能大意，需在孕11周左右嘱咐孕妇复查B超，及时发现稽留流产并及时清宫且留取绒毛染色体检测。

综上所述，可能受样本量的影响，研究中三种检测技术对妊娠早期自然流产绒毛染色体检测成功率及异常核型检出率比较均无差异，各技术各具优势，实际使用时应根据临床实际情况选择，也可结合使用。无论哪种检测方法，异常核型都可供遗传咨询参考，遗传咨询对再次妊娠的指导意义非常重大。建议35岁以上孕8～12周自然流产的患者或有2次以上早期自然流产史的患者进行绒毛染色体检查，检测出绒毛染色体异常者需进行遗传咨询，以降低再次妊娠的流产风险。