荧光原位杂交技术在产前诊断染色体嵌合体中的应用价值

李显筝，许玲，胡晶晶，黎凤珍，蔡婵慧

染色体G显带核型分析技术是目前检测染色体异常的常规手段。在临床工作中，染色体的嵌合现象时有发生，染色体嵌合体中异常核型所占比例不同，对于胎儿的预后影响也不同，从而增加了产前诊断遗传咨询的难度。常规G显带技术细胞经体外培养后会改变异常嵌合体的嵌合比例，不能真实反映胎儿的核型情况。通过染色体微阵列比较基因组杂交检测（chromosomal microarray analaysis，CMA）和荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization，FISH）能检测间期未经培养细胞的嵌合状态，从而减少细胞培养过程对嵌合比例的影响，同时也能减少细胞周期对产前诊断的限制[1]。本文对染色体核型结果提示可能存在染色体嵌合现象的病例进一步用CMA和FISH技术分析确定其异常核型及嵌合比例。

1 对象与方法

1.1 对象 广东省妇幼保健院（我院）2016年1月—2018年12月因各种产前诊断指征就诊的妊娠孕妇，22例行绒毛/羊水细胞体外培养染色体核型G显带分析，发现可能存在染色体嵌合现象，并进一步行CMA和FISH检测。

1.2 方法

1.2.1 染色体核型分析按我实验室操作规程进行，常规核型计数分析，若出现嵌合现象时加大计数量并对备份培养瓶中的细胞进行传代、收获和制片，加数尽量多的核型进行分析。

1.2.2 CMA我实验室使用安捷伦（Agilent）公司（美国）生产的8×60 K芯片进行全基因组拷贝数检测。以正常男性DNA作为对照标准，利用ChAS软件进行分析。

1.2.3 FISH按我实验室操作规程进行，荧光显微镜下阅片分析计数。探针分三组：第一组探针：CEP18（天蓝色）探针定位于D18Z1（18p11.1-q11.1），CEPX（绿色）探针定位于DXZ1（Xp11.1-q11.1），CEPY（红色）探针定位于DYZ3（Yp11.1-q11.1）；第二组探针：LSI13（红色）探针定位于RB1基因（13q14），LSI21（绿色）探针定位于D21S259，D21S341，D21S342（21q22.13-q22.2）；第三组探针：CEP16（红色）探针定位于D16Z3（16q11.2），CEP20（绿色）定位于D20Z1（20p11.1-q11.1）。

1.2.4 羊水染色体嵌合评定标准当2个或2个以上的培养物中都至少发现一个或一个以上的异常细胞克隆，且异常细胞核型相同，判定为“真嵌合体”。若是以下三种情形之一，为“假嵌合体”：①在2个或2个以上培养物中只查到单个异常细胞或细胞克隆；②2个或2个以上的异常细胞克隆都是在同一个培养物中发现的；③2个或2个以上培养物中都发现异常细胞，但异常细胞的核型异常类型不同。

2 结果

2.1 FISH技术在染色体数目异常嵌合体中的应用 本研究核型结果共发现22例染色体嵌合体，其中性染色体数目异常嵌合13例（59%），常染色体三体嵌合6例（27%）。性染色体数目异常嵌合病例中，仅有3例CMA结果同时提示性染色体嵌合体的存在，其余均未检测到性染色基因拷贝数变化，其中#6病例核型结果mos 45，X[84]/46，XY[16]，异常核型45，X比例84%，CMA结果仍提示正常，FISH结果提示存在XYY/X/XY（43/21/36）三种情况；#1、#2病例涉及多倍体嵌合体，FISH及CMA结果均为正常，提示为假性嵌合体，不具临床意义；其余CMA未检测到基因拷贝数变化的病例，虽然FISH复查提示仍为嵌合体，但嵌合比例均在10%左右，属低比例嵌合体，而低比例嵌合对胎儿预后表型影响较小，患者综合考虑选择继续妊娠。常染色体三体嵌合病例中，共涉及13、16、18、20、21号染色体的嵌合。#14病例核型结果提示多了一条未知来源的标记染色体即mar染色体，经CMA和FISH检测提示mar染色体来源于18号染色体短臂，且嵌合比例约为20%左右；#15、#16、#17、#18病例的核型结果均提示为低比例常染色体三体嵌合（嵌合比例6%、6%、4%、5%），CMA结果提示嵌合比例分别为10%、30%、34%、正常，未经培养羊水细胞FISH检测提示三体嵌合比例分别为11%、25%、38%、10%，均选择终止妊娠；#19病例核型结果为20号三体嵌合（34%），但CMA结果提示正常，FISH检测提示仍为低比例嵌合（3%），病人自愿继续妊娠。见表1。

2.2 FISH技术在性染色体结构异常嵌合体中的应用 本研究共发现3例特殊性染色体结构异常嵌合病例，涉及X双着丝粒染色体1例，Y双着丝粒染色体2例。以#22病例为例，该病人CMA结果提示检测出致病性CNV：①胎儿在Yp11.31q11.222位置发生嵌合重复（嵌合比例约50%～60%），片段大小约18.0 Mb；②Yq11.222q11.23位置发生缺失，片段大小约7.8 Mb。

经FISH检测羊水中期细胞分裂相CEP18/X/Y着丝粒区域探针，共发现四种类型结果：（DXZ1×1，DYZ3×0，D18Z1×2）[36]；（DXZ1×1，DYZ3×4，D18Z1×2）[16]；（DXZ1×1，DYZ3×2，D18Z1×2）[14]；（DXZ1×1，DYZ3×1，D18Z1×2）[34]。见图1。

G显带分析羊水细胞染色体发现存在五种不同核型即：mos 46，X，idic（Y）（q11.22）[34]；45，X[12]；46，X，del（Y）（q11.22）[5]；47，X，idic（Y）（q11.22）×2[5]；46，XY[44]，除45，X外其余四种核型涉及四种不同形态的Y染色体。见图2。

3 讨论

传统的细胞遗传学产前诊断是避免染色体异常患儿出生的重要手段。随着产前诊断技术的普及，越来越多的研究发现，羊水和绒毛培养中易出现嵌合现象，这些嵌合体有些是真性嵌合，有些是假性嵌合，如何正确识别，如何正确进行相关遗传咨询，成为目前临床关注的焦点之一。临床上碰到的嵌合体多数为同源性嵌合体[2]，其又可分为真性嵌合体和假性嵌合体。真性嵌合体主要是由于细胞有丝分裂不分离或染色体丢失所致，也可能是因为有丝分裂后期染色单体的迟留，导致个别子细胞及其后代中少了一条染色体[3]。而假性嵌合体则可能是由于胎儿体外不重要细胞增殖、母体细胞污染、胎儿脱落细胞体外培养畸变或染色体制片中产生等。嵌合体胎儿的临床表现，主要取决于异常核型所占比例，异常核型比例越高，临床症状越明显；相反，嵌合体中含正常核型越高，临床表现越轻。一般认为，在羊水培养中胎儿真性嵌合体的发生率约为0.1%～0.3%，在绒毛培养中为0.8%。对于假性嵌合，可以通过CMA和FISH检测技术进一步检测予以排除[4]。

表1 染色体嵌合体相关结果及其妊娠结局

图1 羊水中期细胞分裂相FISH检测结果

图2 羊水细胞染色体G显带核型

采用传统的羊水细胞培养核型分析方法是检测染色体结构重排的金标准，并能检测染色体的非整倍体[5]，但在诊断染色体亚显微小片段结构异常和复杂易位断裂点时仍非常困难。CMA和FISH的应用能弥补传统核型分析的不足，相互补充。

CMA是以微阵列技术为基础的基因组拷贝数变异（copy number variations，CNVs）分析技术，主要包括基于比较基因组杂交的微阵列（array-based comparative genomic hybridization，aCGH） 和基于单核苷酸多态性的微阵列（single nucleotide polymorphismarray，SNParray）[6]。CMA是一种高分辨率的全基因组染色体变异检测技术，近年来其在临床的应用逐步深入和广泛。CMA技术检测未培养细胞基因拷贝数变化，能够检测出染色体微小片段的缺失或重复，弥补传统核型肉眼分辨率有限的不足。但其在聚合酶链反应（PCR）扩增阶段存在优势扩增现象，会影响嵌合体病例中异常核型真实的嵌合比例，同时对于低比例嵌合体（嵌合比例小于20%）的检出率也很有限。而且CMA技术对于复杂结构异常的病例，仅能提示基因拷贝数的变化，并不能直观地确定其结构畸变类型及染色体空间结构变化。

FISH技术是利用荧光标记的特异性寡核苷酸片段作为探针，与染色体、细胞或组织中的核酸按照碱基互补配对原则进行杂交，通过荧光系统检测，对待测DNA进行定性或相对定位分析[7]。相对于传统的核型分析技术，FISH技术具有快速及特异性高的优点。更由于其直观性，成为众多遗传学诊断技术的有效验证方法，具有广阔的应用前景，逐渐成为解决复杂的临床细胞遗传学问题的一种重要方法，是对经典细胞遗传学方法的补充[8]。FISH技术不仅可以直接检测未培养羊水细胞间期细胞，对最常见的非整倍体作出快速的产前诊断，还可以对传统羊水细胞核型分析怀疑异常的病例进行羊水中期细胞FISH检测，以明确胎儿染色体结构异常的来源和准确定位断裂点[9-10]。因此对于部分羊水核型少或怀疑嵌合的患者，取羊水或脐血等直接进行FISH检测，不受细胞培养过程中选择性生长的影响，可以更真实地反映胎儿体内的细胞嵌合状况，对于判断胎儿预后会有更多帮助。目前英国临床细胞遗传协会已把采用间期细胞的FISH技术作为产前嵌合体检查的筛查方法[11]。

本研究染色体嵌合体病例中，性染色体数目嵌合最常见（59%）。核型结果提示嵌合体的病例中，有近50%的病例CMA结果未检测到嵌合现象，虽然FISH复查仍提示为嵌合体，但嵌合比例均在10%左右属于低比例嵌合体，分析原因可能是CMA在检测过程中需进行PCR扩增，从而改变了原有嵌合比例导致低比例嵌合体无法检出。对于本研究中发现的2例多倍体嵌合体病例，其CMA和FISH结果均正常，为假性嵌合，不具临床意义。因常染色体数目异常对胎儿生长发育影响较大，异常核型比例越高，胎儿可能预后越差，本研究中常染色体数目异常嵌合病例多选择终止妊娠，仅1例20号三体低比例嵌合病例选择继续妊娠，需进一步随访生长发育情况。本研究中涉及3例染色体结构异常嵌合病例，且均为性染色体双着丝粒染色体复杂结构嵌合，通过核型分析能够直观看到不同异常核型的形态，但无法确定异常核型来源；通过CMA结果提示性染色体拷贝数变化，异常核型来源可能为性染色体；进一步结合FISH技术检测中期细胞性染色体着丝粒探针，可以明确双着丝粒的存在及其在染色体上的位置。三种技术手段相互结合，相互补充，最终明确了异常染色体来源及其结构变异类型，给出更准确、更直观的染色体核型变异结果。

继续妊娠的嵌合体病例以性染色体数目嵌合为主，目前能够随访到的妊娠结局均未表现出明显的生长发育异常，电话随访家长都反映孩子没有异常，外观能见到是正常男性或女性，考虑性染色体嵌合体可能对患儿青春期发育以及后续生育产生影响，需继续对这些病例进行随访至成年。这些患儿出生后均没有再次复查核型，能够出生后多组织复测核型当然可以更明确患儿的嵌合比例及嵌合现象分布情况，但临床操作起来较难，一方面技术上目前我中心仅能检测外周血核型，其他组织核型检测尚未开展，另一方面相关标本的留取上也存在困难。

综上所述，嵌合现象目前仍是遗传咨询中的一大难题。对羊水染色体分析中判定疑似嵌合体的病例，需采用多种方法加以验证，不应急于终止妊娠，应充分应用CMA、FISH技术结合G显带核型结果进行综合分析，并需要对胎儿形态进行细致的超声评估。从而更加准确地确定嵌合类型以及异常核型的嵌合比例，为临床医师指导遗传咨询提供更加可靠的依据，既能避免正常妊娠的终止，也能保证出生人口的质量。对于自愿保留嵌合体胎儿的患者，应充分告知胎儿可能的预后风险，因异常核型嵌合比例以及嵌合部位不同，对患儿生长发育的影响也不同，应密切关注胎儿出生后的生长发育情况，必要时重新检测患儿不同组织染色体核型嵌合情况。