基于白纹伊蚊Actin基因参照的登革Ⅱ型病毒一步法实时荧光定量PCR检测方法的建立*

李超杰 姜玉庭 张强辉 高 剑 刘 源 邢 丹 李春晓 张恒端 郭晓霞** 赵彤言**

(1.军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全国家重点实验室，媒介生物危害和自然疫源性疾病北京市重点实验室，北京 100071)

登革病毒(Dengue fever virus，DENV)属于黄病毒科、黄病毒属，是有囊膜包被的单股正链RNA病毒(Thanachartwetetal., 2015)。病毒基因组全长约 11 kb，有1个开放阅读框(Open reading frame, ORF)，共编码3个结构蛋白和7个非结构蛋白(Unoetal., 2018)。根据病毒表面抗原的不同，可以分为4种不同的血清型(DENV-1～DENV-4)。埃及伊蚊Aedesaegypti和白纹伊蚊Aealbopictus是登革热的主要传播媒介，其中白纹伊蚊在中国的分布极其广泛，自辽宁省往南的各个省份均有分布。

目前定量检测登革病毒的方法主要是通过实时荧光定量检测登革病毒的含量(Gongetal., 2020)。Alto等(2008)用DENV-2感染伊蚊，发现埃及伊蚊身体中病毒滴度与蚊虫个体大小成正相关，这可能是由于大个体蚊虫摄入了更多的病毒，但是传统的定量检测方法的结果因样本个体差异存在误差。建立白纹伊蚊中登革病毒含量的精确检测方法，对于白纹伊蚊感染登革病毒的研究以及登革热的防控有重要意义。肌动蛋白(Actin) 是一类形成微丝的球状多功能蛋白质，普遍存在于所有的真核细胞中, 是高度保守的蛋白质家族，其在进化的过程中几乎没有变化。肌动蛋白几乎参与了真核细胞的所有生理过程, 如胞质流动、细胞器运动、细胞分裂、染色体运动、细胞激化等(Pollardetal., 1986；Kabschetal., 1992；Chadwicketal., 1999)。由于肌动蛋白的mRNA的表达数量高并且表达稳定，在生物体内持续稳定表达, 所以在很多研究中被当作内参基因(Vascottoetal., 2004)。

本研究采用白纹伊蚊Actin基因表达含量做参照，设计DENV-2和Actin特异性引物和探针进行一步法荧光定量双重PCR检测，使登革Ⅱ型病毒感染白纹伊蚊的实时荧光定量结果更为准确。

1 材料与方法

1.1 白纹伊蚊

研究对象为广州株白纹伊蚊，2019年7月采自广东省广州市，于养虫室连续常规养殖至第4代(F4)。饲养条件：温度28±1℃，相对湿度70%±5%，光照∶黑暗=14 h∶10 h。

1.2 登革Ⅱ型病毒

登革Ⅱ型病毒由广东省疾病预防控制中心提供，在本实验室经乳鼠脑传代，保存于-80℃冰箱。

1.3 主要仪器和试剂

Analytikjena PCR仪(Biometra Tadvanced)、QuantStudio 7 Flex实时荧光定量 PCR仪(appliedbiosystems)、医学昆虫供血器(军事医学科学院实验仪器厂)、RNAiso Plus(宝日医生物技术(北京)有限公司)、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(宝日医生物技术(北京)有限公司，货号：RR047 A)、PrimeSTAR®HS DNA Polymerase(宝日医生物技术(北京)有限公司，货号：RR010 A)、低熔点琼脂(SIGMA公司：SLBJ0416 V)、 EasyPure® Quick Gel Extraction Kit(北京全式金生物技术有限公司，货号：EG101-01)、pEASY®-Blunt Zero Cloning Kit(北京全式金生物技术有限公司，货号：CB501)、EasyPure®HiPure Plasmid MiniPrep Kit(北京全式金生物技术有限公司，货号：EM111-01)、GoTaq®Probe 1-Step RT-qPCR System试剂盒(Promega公司，货号：A6120)。

1.4 引物和探针合成

针对登革Ⅱ型病毒3′UTR区域和白纹伊蚊Actin基因保守区设计引物，登革Ⅱ型病毒基因和白纹伊蚊Actin基因的探针5'端标记的荧光基团分别为FAM和HEX。引物序列在华大基因合成。

1.5 标准品的制备

分别提取白纹伊蚊和DENV-2的总RNA，逆转录为cDNA后，PCR扩增分别获得白纹伊蚊Actin和DENV-2目的片段(反应条件：95℃ 5 min; 95℃ 30 s, 58℃ 30 s, 72℃ 30 s, 35 cycles; 72℃ 5 min)。将得到的PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，用凝胶回收试剂盒纯化目的片段。将纯化后的目的片段与质粒连接，转化到感受态细胞中，复苏培养1 h，涂在准备好的LB固体培养基上，过夜培养后挑选白色菌落在LB液体培养基中培养2 h，测序。将含目的基因的菌落扩大培养，提取质粒并测得质粒浓度，计算出目的基因相对应的拷贝数。把已知浓度的质粒稀释至108～101copies/μL，作为后续荧光定量PCR的标准品。

1.6 一步法实时荧光定量 PCR方法的灵敏度和重复性

将构建好的标准品质粒稀释为1×108～1×101copies /μL系列梯度浓度，确定所建立方法的最低检测拷贝数；实验重复3次，计算3次之间的平均Ct值及各梯度浓度的变异系数，检验稳定性。

1.7 白纹伊蚊经口感染DENV-2

白纹伊蚊羽化5～7 d后断糖水16～18 h，使用医学昆虫供血器喂食病毒血餐。血餐用登革Ⅱ型病毒悬液和昆明小鼠血按1∶1的比例混合而成，DENV-2的滴度为6.9×107PFU/mL。喂食白纹伊蚊1 h后，使用CO2麻醉，挑取饱血的雌蚊100只，感染后蚊虫置于温度28±1℃，相对湿度70%±5%，光照：黑暗=14 h:10 h的环境中饲养。

1.8 白纹伊蚊总RNA提取和检测

分别于染毒后第4、7、10 d取30只白纹伊蚊，处死后置于1.5 mL EP管中，加入1 mL RNAiso Plus提取蚊虫总RNA。使用Promega一步法实时荧光定量试剂盒检测白纹伊蚊体内DENV-2的含量和Actin基因的表达量(反应条件：45℃ 15 min; 95℃ 10 min, 95℃ 15 s, 60℃ 60 s, 40 cycles)。

2 结果

2.1 一步法实时荧光定量 PCR 方法的灵敏度和重复性

用上述条件建立一步法实时荧光定量 PCR 检测拷贝数分别为1×108～1×101copies /μL的DENV-2和白纹伊蚊Actin基因重组质粒，结果显示DENV-2的最低检测浓度为1×102copies /μL，而白纹伊蚊Actin基因的最低检测浓度为1×101copies /μL。DENV-2标准曲线 (图1)的线性回归方程为y=-3.8894x+ 42.552，相关系数0.999，白纹伊蚊Actin基因标准曲线 (图2) 的线性回归方程为y=-3.8814x+ 42.768，相关系数0.999，两者标准曲线均具有良好的相关关系。上述实验重复检测3次后，DENV-2重组质粒的变异系数在0.79%～2.66%之间(表2)，白纹伊蚊Actin基因重组质粒的变异系数在0.38%～4.33%之间 (表3)，变异系数较大的样本浓度主要是1×101copies /μL，证明该检测方法在1×102～1×108copies /μL之间重复性最好。

图1 梯度稀释登革Ⅱ型病毒阳性模板核酸的标准曲线

图2 梯度稀释白纹伊蚊Actin基因阳性模板核酸的标准曲线

图3 不同天数白纹伊蚊登革Ⅱ型病毒与Actin基因表达量的比值

2.2 登革Ⅱ型病毒复制动态检测

根据上述方法，检测白纹伊蚊吸食DENV-2型病毒血餐后，登革Ⅱ型病毒和白纹伊蚊Actin基因的表达量在第4、7和10 d的变化情况 (图3)。在第4 d DENV-2的感染率为0%，第7 d的感染率为37%，第10 d的感染率为30%。第7 d DENV-2与Actin基因的比值在0.51～0.93之间，第10 d DENV-2与Actin基因的比值在0.63～0.94之间(表4)。第7 d阳性蚊虫比值的平均值为0.72，标准差为0.17；第10 d阳性蚊虫比值的平均值为0.80，标准差为0.09，应用 SPSS统计软件，第10 d的比值平均值高于第7 d的比值平均值，P<0.05，差异具有统计学意义，即第10 d的病毒含量高于第7 d的病毒含量(表5)。

表1 登革Ⅱ型病毒和Actin的引物及探针序列

表2 登革Ⅱ型病毒检测时各梯度浓度的Ct值及变异系数

表3 白纹伊蚊Actin基因检测时各梯度浓度的Ct值及变异系数

表4 阳性蚊虫DENV-2与Actin基因表达量的比值

表5 阳性蚊虫DENV-2与Actin基因表达量比值的比较

3 讨论

目前常用的登革病毒检测方法为仅使用病毒特异性引物和探针对病毒进行绝对定量分析(Houetal., 2013)，但是即使是同时孵化的一笼蚊虫，其个体大小也存在较大的差异。Fish(1985)调查了美国东北地区10种雌性成蚊的个体大小，其变异系数(CV)为10.51%～38.13%。在野生环境中，个体大的蚊虫拥有更长的生命，更强的飞行能力和迁徙能力，因此能有更多的机会吸食宿主的血液，拥有更强的竞争优势与疾病传播能力(Haramis, 1985; Nasci, 1986)。Alto等(2008)的研究表明在实验室条件下，小个体白纹伊蚊和埃及伊蚊比大个体蚊虫更容易感染和播散DENV-2。但是在感染了病毒的埃及伊蚊中，身体中病毒滴度与个体大小成正相关，作者给出的解释是大个体蚊虫拥有更多供病毒复制的组织。但我们认为大个体蚊虫可以一次摄入更多的病毒血餐，这可能在对比不同处理条件下病毒载量的实验中带来影响，而用病毒核酸与内参表达量的比值来反映每个蚊虫个体中病毒的量则能消除个体大小带来的差异，结果更加具有说服力。

在本研究中，标准曲线相关系数均大于0.999，拟合效果较好。每个标准阳性样本3次重复的变异系数均不超过5%，重复性较好。DENV-2和Actin的最低检测浓度分别为102和101copies/μL，灵敏度较高。另外本研究中的白纹伊蚊Actin引物同样可用于C6/36细胞的检测(数据未展示)。