壮药山风总黄酮提取工艺的优化研究

莫 婵，覃晓霞，谢明秋，庞光福，黄锁义

(1. 右江民族医学院 临床医学院，广西 百色 533000；2. 右江民族医学院 科学实验中心和广西高校右江流域特色民族药研究重点实验室，广西 百色 533000；3. 右江民族医学院 药学院，广西 百色 533000)

山风(Blumeaaromatica(Wall.) DC.)是一种多年生草本植物，菊科艾香属，学名为馥芳艾纳香，别名香艾等[1]。山风为广西壮族的道地药材，全草药用，味辛、微苦，性温，气香，具有祛风除湿、消肿止痛、通经活络的效用，民间主要用于治疗风寒湿痹、关节疼痛、风疹、湿疹、皮肤瘙痒、外伤出血等症[1-3]。黄健军等研究表明，山风、山芝麻的正丁醇提取物与云南白药牙膏在对抗二甲苯所致的小鼠耳廓肿胀、局部创面出血时间方面作用相当，具有良好的消肿止血作用[4]。山风中含有黄酮、蒽醌、酚类等化合物[5]。研究发现，黄酮类化合物具有一定的抗炎、抗氧化、抗辐射、抗肿瘤、保肝、抗骨质疏松以及保护心脑血管等多种保健作用，对病毒、细菌都有较好的抑制活性[6-8]。目前，国内有关壮药山风的化学研究鲜有报道[1,5,9-11]，尚未发现有关壮药山风中总黄酮提取工艺的报道。为了更好的开发和利用山风，本试验对广西壮药山风中黄酮类物质进行提取研究，在单因素试验基础上，进行正交试验优化山风黄酮的提取工艺，为山风的药用及功能性食品开发利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 仪器

FA1204B型电子天平(上海天美天平仪器有限公司)、KQ5200DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器公司)、SHB-III循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)、N4S型紫外可见分光光度计(上海仪电分析仪器有限公司)、TDL80-2B台式离心机(上海安亭科学仪器厂)、R-100型旋转蒸发仪(瑞士步琦公司)、DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏试验设备有限公司)、TH-UP-10实验室专用超纯水机(山东滕海分析仪器有限责任公司)。

1.2 材料

山风，购于广西百色市，经右江民族医学院中药学教研室周世友副教授鉴定为菊科艾香属的药材山风(B.aromatica(Wall.) DC.) 全草；芦丁对照品(上海金穗生物科技有限公司，批号: 20151022，含量≥98%)；95%乙醇、无水乙醇、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝等均为分析纯。

1.3 试验方法

1.3.1 对照品溶液制备

精密称取密封保存的干燥芦丁对照品14.5 mg，置于50 mL容量瓶中，加60%乙醇溶液至50 mL定容制得质量浓度0.29 mg·mL-1的芦丁对照品溶液。

1.3.2 芦丁标准曲线绘制

分别精密吸取芦丁对照品溶液(0.29 mg·mL-1)0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于10 mL具塞比色管中，加浓度30%乙醇至5 mL，分别加入5%亚硝酸钠溶液0.30 mL，摇匀，静置6 min；再加10%硝酸铝溶液0.30 mL，摇匀，静置6 min；再加4%氢氧化钠溶液4.00 mL，用60%乙醇稀释至刻度，摇匀，静置15 min，以不加芦丁标准溶液的试剂作为空白，在400～800 nm处进行全波长扫描，确定最大吸收波长为511 nm，于波长511 nm处测吸光度(A)值,平行3次。分别以吸光度值、芦丁浓度(mg·mL-1)为纵、横坐标，进行线性回归，得回归方程Y = 12.755X + 0.018 (mg·mL-1)，r = 0.9993，表明芦丁在29.00～145.00 mg·mL-1线性关系良好。

1.3.3 供试品溶液制备

取壮药山风于60℃恒温干燥箱干燥，粉碎过60目筛，密封保存于阴凉干燥处待用。精密称取山风粉末3.000 g，分别置于圆底烧瓶中，用一定浓度的乙醇溶液超声处理一定时间，放冷，混匀，过滤及浓缩后移入50 mL容量瓶中，用60%乙醇溶液定容，摇匀，得供试品溶液。取适量供试品溶液离心，精确吸取离心上清液0.2 mL于试管中，然后依照1.3.2方法于511 nm波长测定吸光度，计算总黄酮含量。计算公式如下：

式(1)

式(1)中：Y=12.755X+0.018 (mg·mL-1)，A指提取液的吸光度值，V指稀释倍数，W指提取所用的山风的质量(g)[12]。

1.3.4 精密度试验

精密吸取对照品溶液4.00 mL，按2.3项方法制备供试液，准确吸取供试液0.2 mL，置于10 mL具塞比色管中，按1.3.2项显色，以不加芦丁标准品的溶液作空白，连续测定其吸光度6次，RSD = 0.09%(n = 6)，表明仪器精密度良好。

1.3.5 稳定性试验

精密吸取供试品溶液4.00 mL，按1.3.2项显色，分别在0，15，30，60，90，120 min测定其吸光度，RSD = 1.44%(n = 6)，结果表明，供试品溶液在2 h之内较稳定，满足试验要求。

1.3.6 重复性试验

称取6份山风粉末，每份精确至3.000 g，按1.3.3项制备供试品溶液。精密吸取供试品溶液，操作同1.3.2项，分别测定其吸光度值，RSD = 3.52%(n = 6)，表明该分析方法重复性良好。

1.3.7 优化总黄酮提取条件的正交试验

按照1.3.3项提取山风中的总黄酮，以总黄酮含量作为考察指标，通过单因素试验分别考察各因素对黄酮类化合物得率的影响，从中优选出3个水平，设计四因素三水平L9(34)的正交试验，优选壮药山风黄酮类化合物最佳提取工艺参数。单因素试验因素及水平见表1，L9(34)正交试验因素与水平见表2。

1.4 数据处理

采用 Excel 2003软件和SPSS 13.0统计软件对试验数据进行统计与分析。

表1 单因素试验考察的因素与水平

2 结果与分析

2.1 影响山风中总黄酮提取率的单因素试验

2.1.1 提取温度对山风黄酮类化合物提取效果的影响

从图1可以看出，提取温度在40～70℃之间总黄酮提取率逐步上升，70℃时达峰值，其原因可能为温度升高，分子运动增强，细胞膜结构变化，导致黄酮类化合物质析出量增高；但随温度的增高，黄酮受到氧化[13]，使其化学结构改变，再者乙醇挥发速度加快，溶解在乙醇中的黄酮类物质较少，从而测得黄酮含量有所下降。故取60、70、80℃进行正交试验。

2.1.2 乙醇浓度对山风黄酮类化合物提取效果的影响

从图2可以看出，随着乙醇含量升高，山风提取液中黄酮类化合物的含量呈先上升后下降的曲线变化。乙醇浓度为50%～60%之间时黄酮类化合物的含量上升缓慢，提高乙醇浓度可以提高乙醇对山风的渗透性，从而提高黄酮提取率。乙醇浓度为60%～90%之间时黄酮类化合物含量急剧下降，在60%时产生峰值。结果表明，乙醇适宜浓度在60%左右，因为山风中含有的黄酮类化合物易溶于乙醇等有机溶剂难溶于水，所以当乙醇浓度增加时溶解于乙醇的黄酮类物质增加，乙醇和水达到一定比例时黄酮提取率最高。由于乙醇浓度过高时沸点下降、挥发严重，同时一些醇溶性物质、色素、脂溶性强的物质溶出量增加，竞争性抑制黄酮类物质与乙醇结合，从而测得黄酮含量有所下降[14]。故选取乙醇浓度50%、60%、70%进行正交试验。

2.1.3 料液比对山风黄酮类化合物提取效果的影响

由图3可知，随着料液比增大，黄酮类化合物析出量在1∶10～1∶40 g·mL-1之间上升，料液比为1∶40 g·mL-1时黄酮类物质基本从组织细胞内溶解在溶剂中，料液比1∶50 g·mL-1明显比1∶40 g·mL-1析出黄酮类化合物少，出于试验成本和提取率的考虑，故选取1∶30、1∶40、1∶50 g·mL-1为较佳料液比参与正交试验。

2.1.4 提取时间对山风黄酮类化合物提取效果的影响

图4 提取时间对山风黄酮类化合物提取效果的影响Fig. 4 Effects of time on flavonoids extraction from B. aromatica

从图4可以看出，提取时间20～40 min时黄酮提取率缓慢上升，提取时间超过60 min黄酮提取率缓慢下降，40～60 min之间提取率差别极小，提取时间继续增加对提取效果影响不大。这可能是因为黄酮类化合物析出需要与乙醇接触一定的时间，超过60 min后由于乙醇更易挥发，黄酮类物质结构容易改变，且超声时间过长，有些粗提取物杂质溶解于溶剂中、黄酮糖苷类的水解、黄酮类物质被氧化等原因[15]，提取率下降。出于实验成本和提取率考虑，取20、40、60 min作为较佳提取时间参与正交试验。

2.2 正交试验优化山风总黄酮提取结果及分析

按照1.2.3的方法提取山风中黄酮类化合物，正交试验结果见表3，方差分析及显著性检验结果见表4。

表3 L9(34)正交试验及结果

表4 方差分析结果

注:F0.01(2，2) = 99，**表示P< 0.01差异极显著；F0.05(2，2) = 19.0，*表示P< 0.05差异显著。

从表3可知，R值与该因素的水平变化对试验结果的影响呈正相关关系。因此，4个考察因素对黄酮提取率的影响因素顺序由大到小为提取温度>料液比>提取时间>乙醇浓度，最佳组合为A3B2C2D1，即提取温度为80℃、乙醇浓度为60%、料液比为1∶40 g·mL-1、提取时间为20 min为山风中黄酮类化合物的最佳提取条件。表4提示，A、C因素对山风总黄酮的提取有显著影响意义，B、D两因素无显著影响意义。由F值的大小可知，方差分析结果和极差分析结果相同。

2.3 验证试验

因A3B2C2D1未包括在所设计的正交试验设计表中，故在正交试验所得的最佳提取工艺条件A3B2C2D1平行操作三次，测定吸光度并计算黄酮含量(表5)。

表5 工艺验证试验

如结果所示，参照最佳工艺条件提取，提取物中的总黄酮含量均较高，所以该工艺条件合理，具有较好的稳定性。

3 讨论

近年来，超声波技术应用于提取各种天然活性物质日益普遍，与传统加热回流提取方法相比较，具有省时、节能等优势[16]。超声波辅助提取工艺即利用超声波具有的空化效应、机械效应和热效应等，破坏植物细胞壁，增加细胞膜及细胞壁通透性，提高溶剂穿透力，优化物质中有效成分提取的工艺技术[17]。本试验通过采取超声波辅助乙醇加热回流提取壮药山风中的黄酮类化合物，提高了试验效率。黄酮类化合物成分定量方法有多种，主要有紫外分光光度法、比色法、高效液相色谱法等。本试验采用的紫外分光度法具有准确性高、操作简便、方法易掌握等特点，用于测定山风提取液中总黄酮含量具有误差小、效率高、可行性强等优势。

艾纳香属药用植物具有重要的药用价值，在民间均以水煎服用，治疗类风湿性关节炎、妇女功能性子宫出血、产后出血、产后祛风除湿、杀菌止痒等症有独特疗效[18]，在少数民族地区得到广泛使用，可见其药用价值不可忽视，极具开发利用潜力。菊科艾纳香属植物名称上易混淆，其功效、主治各有不同，因此有效地鉴别显得极其重要。宋志军等人通过测定馥芳香艾纳素的含量鉴定方法有助于鉴别壮药山风真伪[19]。本研究以壮药山风为原料，乙醇为提取溶剂，辅以超声波回流提取，经过单因素试验筛选出较佳提取因素水平，采用正交试验对壮药山风总黄酮的提取工艺优化。结果表明：影响壮药山风总黄酮提取量的因素主次顺序为：提取温度>料液比>提取时间>乙醇浓度，最佳组合为A3B2C2D1，即最佳提取条件为提取温度为80℃、乙醇浓度为60%、料液比为1∶40 g·mL-1、提取时间为20 min。在优化的工艺条件下，进行三次验证试验，总黄酮的提取率平均为24.72 mg·g-1。本次试验为进一步开发壮药山风的药用及功能性食品利用价值提供理论参考。