诊断业之窘

韩璐

疫情洶汹，确诊人数为千万人关注。在关键区域的湖北，诊断标准中途则有调整！

2月初，《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第五版）》发布，国家卫健委将CT影像结果作为诊断标准（只限于湖北省），“疑似病例具有肺炎影像学特征者”，即为临床诊断病例;2月中旬，公布的第六版方案规定，“具有肺炎影像学特征者”，作为疑似病例的判定标准。

湖北将CT临床诊断病例数纳入“确诊”统计后，单日新增新冠肺炎病例一度过万，大大加速了诊断的效率。CT影像技术的深度介入，却使核酸检测技术以及诊断业陷入尴尬。

假阴性感染者频繁出现、检测效率被指低下、试剂质量受质疑，很多人开始质疑核酸检测技术临床应用价值。中国医学科学院院长王辰公开表示，“核酸对于真实病例的检测率不过30%至50%”。

一项成熟的诊断技术，为何在此次疫情中马失前蹄？诊断业缘何陷入20年来的又一次危机？

意外的质疑

诊断方案调整之前，核酸检测是公认的确诊标准。

中国科学院神经学科研究所研究员仇子龙告诉《21CBR》记者，病毒是一种携带遗传信息的微生物，遗传信息的储存形式是核酸，核酸分为DNA和RNA，RNA是遗传信息DNA转变为蛋白质的中间态。

检测到病毒的核酸，就能确认病毒存在。“对于新冠病毒的确认，核酸检测一定是确诊标准，只有在呼吸道分泌物中发现核酸，才能确诊患者。”仇子龙说。

金斯瑞生物科技提供了部分检测试剂，其生命科学总裁邵炜慧表示，区分新型冠状病毒感染和普通感冒，核酸检测是相对快速准确的检测手段，通用的是反转录定量荧光PCR检测法，艾滋病、SARS也以此检测。因为新冠病毒是单链RNA病毒，有一个逆转录过程，将原来的RNA病毒逆转录成为DNA链，就可进行PCR检测。

那么，新病毒出现后，如何开发试剂？

首先要了解病毒，进行全基因组测序，获得基因组序列，以新型冠状病毒为例，试剂公司会将病毒的全基因组序列和人类的全基因组序列等对比，找出其独特序列特征，作为检测的靶向序列。

“病毒基因组一般在3万个碱基左右，和人类30亿个碱基相比，单链RNA病毒基因组不会太大。找到特异性序列后，再根据生物学分析，基于很难改变的生物特性，寻找到合适的参照序列。” 邵炜慧解释，金斯瑞此次交付的试剂，加入了体外合成的阳性参照质粒，作为实际合理性的关键判断原料，可辅助判断结果是否可靠。

“核酸检测不是一项新技术，包括亲子鉴定、核酸提取这类体外诊断，技术成熟，已有数十年商业实践，病毒一旦序列确定，就可提供相应引物探针和对照物。检测时将个体DNA或RNA样本扩增到10的7次方倍，精准度几乎可达到99.999%，这在行业里是共识。”有业内资深人士告诉《21CBR》记者。

日常临床诊断中，核酸检测一直担负结核、乙肝、甲流、艾滋病等多类病毒检测的重任，成熟项目的检测，准确率均可达到90%-95%以上。

据了解，一个完整的体外诊断产业链，合成试剂、诊断方案等产品后，再交付测序以及诊断类公司进行组装成检测盒，进入到临床诊断，供给拥有检测资质的机构使用;其关键在于原材料：试剂。高质量、高标准的试剂制备，直接影响检测方法的可靠性与一致性。

没想到，成熟的老技术，偏偏遇到新问题。张笑春是第一个公开质疑核酸检测准确率的医生。

2月3日，这位身处疫情一线的武汉大学中南医院影像科副主任，在朋友圈高呼“别再迷信核酸检测了”，其截图广为流传，呼吁在武汉疫区，应以CT影像作为筛查的主要依据，给予核酸检测阴性但CT影像阳性的人予以隔离，以防家庭聚集感染，使疫情进一步蔓延。

其后，陆续有感染者多次诊断“假阴”，个别病例经历3-4次核酸测试才确诊。由此，确诊标准的讨论进入公共舆论场。核酸检测技术为什么失灵了？

仓促应战

“核酸检测本来是病原体检测的最好方法，但是疫情情势所迫，只能匆匆上马，投入研究的时间和精力都不够。”上海复星长征医学科学有限公司副总经理杨志军认为，由于疫情十万火急，核酸检测用品不得不仓促上阵，这是一个重要原因。

早在1993年，复星长征即研发了第一款医疗产品PCR乙肝诊断试剂，其后一直专注于试剂研发生产。

从时间周期看，通常一款新试剂，实验室研发阶段要在1年左右，加上临床研究和报批时间，一般需要3年左右。现实是，疫情防控刻不容缓，试剂从研发到生产的时间，不足一个月。

“得到病毒序列后，设计多对引物和探针，进行原材料研究及检验，研发生产工艺和质量检验规程，进行半成品和成品检验，完成三批试剂的初步性能研究，如果加班加点，大概只要一个星期左右。”杨志军说，快速制作试剂固然可以，“然而，本质上只是一个科研试剂盒，不是临床诊断试剂盒”。

应对疫情需要，应急审批下不得不省略很多研究内容，如生产工艺和质检规程的可靠性研究、日间精密度、储存稳定性、运输稳定性、开瓶稳定性、适用样本类型、样本稳定性、阳性判断值研究、临床研究等重要环节。

举例来说，试剂开发过程有一项重要环节，称作“阳性判断值研究”，要用大量已知结果的临床标本，研究合适的阳性判断方法。具体到应急批准的试剂，有单靶标、双靶标、三靶标试剂。“各有各的阳性判断方法，比较三种试剂的阳性判断方法后，会发现明显的冲突。”杨志军说。

比如，单靶标试剂检测ORF1ab基因，只要检测结果阳性，就认为患者感染新型冠状病毒;双靶标试剂一般检测ORF1ab基因和N基因，两个基因同时阳性才能判定为阳性。

如果单靶标试剂是准确的，那么双靶标试剂会造成漏检，因为多了一个限制条件;如果后者是准确的，那么前者存在假阳性，因为少了一个限制条件。

再看三靶标试剂，检测ORF1ab基因、E基因和N基因，说明书上推荐的是ORF1ab基因阳性时，E和N任意一个阳性即可判定阳性，不只与前两种存在差异，且又不同于主管部门的建议——三个基因中任意两个阳性就判断为阳性。

到底哪一种检测试剂、哪一种判断方法与临床实践最吻合，尚无定论。

从研发成本看，通常一款试剂的直接投入在百万元上下，应急试剂的临时性投入，成本则高得多，不只是人员调配，还有大量缺乏临床病例研究下的试验成本。

“我们不完全清楚病毒自身的特性和临床表现，时间紧迫，开发试剂时也无大标本可用，很大程度上，阳性判断方法只能凭经验进行设定，所以，药监局是以临时应急审批的方式批准上市，而不是正式批准。”杨志军解释说，任何产品，生产不难，精准不易，核酸检测试剂更是如此。

由于情况紧急，研发、生产、质量控制的各环节均受限于时间，因此，检测试剂盒的品质很难保证。其实，即便产品好，也不能应对临床诊断的现实问题。

不过，仇子龙认为，检测试剂有质量问题的概率非常低，“核酸检测试剂的生产并不难，基本不会成为检测假阴性率高的原因，或者说只要样本有病毒存在，能获批的试剂盒，影响检测质量的可能性可以忽略。”

操作之困

检测盒的制备，到一线临床运用之间，操作流程隔了几道“门”，均会影响检测准确率。

邵炜慧解释，检测试剂盒的准确程度与实验结果，受到多环节、多因素影响，包括样品病毒浓度、检测操作标准等，比如，病毒浓度过低，逆转录后扩增也达不到检测阈值，检测盒检测不到，就会导致假阴性。

有资深人士向《21CBR》记者解释，造成假阴性结果的原因，矛头不能单一指向核酸检测技术或者质量问题。

“疫情严峻，在核酸检测过程中，匆忙之中，试剂盒的冷链运输、低温存储是否符合各大供应商温度标准？在临床采样过程中，是否有效采到带病毒的体液或者分泌物样本？各大实验室在检测过程中，是否确保了实验室环境满足条件？均是非常重要的变量，这些会影响准确率。”

据了解，整个检测过程要经过样本收集、医院登记、送检、反馈结果等多个步骤，每个步骤是否严格执行，均会作用于最终结果。

以取样为例，就大有学问。

从疾病自然史来说，从病毒入侵、复制直到上呼吸道、下呼吸道相继出现症状，是一个连续过程，取样时患者可能处于某一特定的阶段。从病毒入侵到能够检测出的时间段称为“窗口期”。

杨志军坦言，现在不清楚新型冠状病毒侵入人体的具体途径，只能做出假设。从已发表的资料来看，从上呼吸道出现症状到呼吸窘迫的时间，大概3-7天，中位数是5天。

“一旦出现下呼吸道症状，病毒在上呼吸道样本中的检出率会降低，如仅仅取上呼吸道标本，就容易造成漏检。”杨志军说，目前上呼吸道采样普遍用咽拭子，而从实际经验看，鼻咽拭子的检出效果会更好，至少，从过往甲流检测看，鼻咽拭子相比咽拭子的检出率要高10%-20%。

“新冠病毒专门感染下呼吸道，也就是肺部，肺部细胞感染病变后，产生的黏液和病变组织通过咳嗽的方式，也很难出来。”仇子龙告诉《21CBR》记者，一般患者无法采用肺泡灌洗液的方法，准确吸取肺泡组织附近的样本，只能采取咽喉部棉签刮擦取样，而肺部病变组织却未必能在咽喉处取得到。

单是取样的原因，就可能造成患者出现“假阴性”。

此外，除了取样本身难，对于检测设备和人员都有要求，比如，实验室的设备能不能高负荷运转，配缓冲液的人手够不够？有些样本检测阴性后，是不是要多重取样做复核？这些都影响检测效率。一有瓶颈，就会体现在周转时间长以及一次检出率低，进而影响患者的最终确诊。

即便如此，张笑春仍然公开解释，并未否定核酸检测结果，而是认为其作为检测的最终手段，受到产量、采样方式等限制，武汉等地无法完全依赖核酸检测去筛查病人。

非常时非常法

对一线疫区的医护来说，关键是提高效率，宁错勿漏。

实践中强硬一方主张将CT影像出现问题即确诊，并视作“曹操式”操作，“宁可错杀一千，不能放过一个”。特别是目前一线疫情诊断上，漏诊、误诊现象并不少。也有一方相对稳健，强调完整的流行病学、影像学和病原学同时互补确诊，要证据确凿。

一位资深生物技术研究人员告诉《21CBR》记者，检测界并不认同以CT影像为单独诊断标准的建议，至少不认可大众将CT和核酸检测放在对立面上的做法。

在技术上，核酸检测、CT两者相互印证、双向辅助无疑是最理想的。至少操作上，新型冠状病毒感染肺部，咽喉处取呼吸道分泌物样本进行核酸检测，确实不易准确反映病情;而且，疫区大量感染人员往往处在疾病初期，用核酸检测更不容易检测。

大敌当前，非常时非常法。

从医学诊断角度来看，如果在疫区肺部CT出现明确的临床指征，有很大概率是新型冠状病毒感染的肺炎，这样“宁枉勿纵”，不等确诊，马上隔离治疗，是阻隔传染的最有效办法。

一位曾参与抗击SARS、现在一线支援的临床医生，向记者肯定了CT检测的建议：“从目前数据看，插管病人从气道分泌物中采样的阳性率非常高，但是，由于其他取樣方法不到位等原因，实际检出率还不够，而CT就够快，尤其在疫区，只要有白肺，十有八九就是新冠病毒感染，立刻确诊隔离是最好的。”这样，在紧急关头，就能起到有效甄别早期病症的重要作用。

他告诉《21CBR》记者，不建议在其他地区采用此方法的原因是，很多流感感染也会引起白肺，加上其他地区的核酸检测时间短，流程和武汉当地不一样。

“以上海为例，一旦CT出现白肺，就进入该医院隔离观察区，耐心等待核酸检测结果。从确诊的技术角度，一定是要经过核酸检测这一病原学确认的。”这位医生解释道。

不过，临床诊断采用CT检测，在实际应用上，也具有挑战性：扫描时间短，阅片时间长;检查时间短，消毒时间长，其最大瓶颈是检测通量小。

“病人一个接着一个做扫描，扫描时间只要几分钟，但是扫描结果要影像科医生读片。面对疑似病例，诊断室和CT机器必须做好全面消毒工作，工作量可想而知，与病患有接触史的人可能达数万名，在快速诊断方面会有挑战。”仇子龙告诉《21CBR》记者，用CT作为诊断方法还有一些其他问题，比如对于孕妇及儿童不一定合适，也不能排除其他病毒导致的肺炎。

这意味着，在湖北这样疫情严重的地区，落实CT影像诊断，需要各方大量协同，协调资源。不过，官方在2月初即明确规定将CT影像结果作为湖北省诊断标准，也代表了决策层疫情防控“不落一户、不漏一人”的决心。

亡羊补牢

CT对核酸阴性的典型症状者的诊断，固然有价值，但是，多位技术专家告诉《21CBR》记者，无论理论或实践上，CT都不可能替代核酸检测。检测病原体，最可靠方法就是核酸检测，效率和成本最理想。

截至卫健委发布的第六版诊疗方案，也依然将核酸检测呈阳性作为确诊的两大标准之一。诊断业也加紧研发，以图亡羊补牢。

比如，复星长征研发完成新型冠状病毒核酸检测试剂，并申请了国家药监局应急审批。该产品可实现对新型冠状病毒ORF1ab、N、E三个基因靶标的定性检测。

截至2月初，该款试剂已完成300多例临床标本，临床数据来看，暂未发现“假阴性”问题，准确率相当高，配合自动化监测，可更快速检测出无发热、无症状患者。

“我们测算了全自动核酸提取仪的检测效率，只要配套快速核酸提取仪及提取试剂，一个实验室三个分区可连续作业，只需两个操作人员，目前记录是2小时内完成96个样本的全部检测。”据杨志军透露，以此换算，一个三甲医院，如果拥有3-5台自动提取仪，一天检测样本可以超过1000人份，远超目前200份/天的水平，使大规模筛查疑似患者成为可能。

1月底，A股上市公司凯普生物也宣布完成新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法和Sanger测序法）两款产品的研制工作，两款检测试剂盒在2小时左右即可出具检测报告。

2月中旬，呼吸疾病国家重点实验室对外透露，在钟南山院士的指导下，其联合多家机构研发出了新型冠状病毒IgM抗体快速检测试剂盒，相比RT-PCR核酸检测，检测更加简单高效，灵敏度强和特异性高，“仅需采取一滴血就有望在15分钟内肉眼观察获得检测结果”。

“进一步提高检测的精准度，试剂中长期稳定性、不同样本类别及其稳定性、不同仪器临床样本检测的匹配性等方面，都还要研究。”杨志军认为，尽管在补救，但是，本次疫情触发的普遍质疑，已成为核酸检测行业在临床应用遭遇的第二次危机。

他引用了辛弃疾的一句词形容当下的窘境：“元嘉草草，封狼居胥，赢得仓皇北顾。”

回想第一次危机，发生在1998年。由于核酸检测滥用，当时主管部门不得不暂停其临床应用，随后，出台一系列管理规定，举办多场次的临床应用培训班，使核酸检测成为临床信赖的检测手段。

历经20余年的努力，在新冠肺炎之前，没有医生质疑核酸检测的可靠性。这一次，该项技术会陷入临床一线以及大众的舆论场，杨志军也始料未及。他很遗憾，2003年SARS病毒之后，由于缺乏相应的制度支持，类似冠状病毒的试剂研发没有延续下去，否则不至于如此被动，这次的匆忙上架，大量从未做过呼吸道病毒检测试剂的企业也不得不一起参与。

“这场危机要求行业内的每一個人认真反省，积极改进，我们要做好提前工作，而不是被病毒追着跑。”杨志军说。