植物组织培养中污染防治方法研究

唐佳佳 徐飞扬

摘   要：污染是植物组织培养中三大难题之一，严重影响培养物的生长与分化，增加了科研和生产运行成本甚至无法进行。通过分析植物组织培养过程中污染引发的原因，总结较好的污染防治方法。

关键词：植物组织培养;污染;防治

植物组织培养中的污染指的是培养期间培养基、培养材料生成杂菌，导致培养失败。造成污染的原因很多，从时间角度可以将污染发生原因归纳为3个阶段：前期准备阶段，包括培养基灭菌不彻底、器皿的灭菌不完全，外植体的选择不当与消毒不彻底;无菌操作阶段，包括无菌操作室灭菌和超净工作台有问题，操作不规范，操作工具的消毒不彻底等;培养阶段，培养环境不清洁和培养体系意外开放等。

1     前期准备阶段

1.1   器具的准备与灭菌

组织培养阶段常用的培养器皿有三角瓶、试管、培养皿、玻璃瓶等，洗衣粉水浸泡冲洗干净后，用蒸馏水润洗瓶的内壁，烘箱烘干备用。

1.2    培养基

1.2.1  母液的配制与保存。配置母液的药品采用纯度较高的分析纯或化学纯，用水采用纯度较高的蒸馏水或去离子水（配制培养基时的用水一样），以免带入杂质和有害物质污染培养材料，分别配制、单独保存于冰箱，低温4℃。

1.2.2   培养基的成分、pH、琼脂。（1）减少培养基中的有机成分。宋锋惠等[1]去除培养基中的有机成分（保留了肌醇），发现对阿月浑子丛生芽增殖没有影响，还抑制了细菌生长，分析认为细菌生长可能需要有机成分。无糖培养去除培养基中的糖及有机成分，以CO2作为碳源，污染率明显降低。（2）降低pH。大多数细菌在pH小于4.5h不能正常生长，周俊辉等[2]通过酸化培养基，使蔷薇属植物在组织培养中出现的细菌污染减少。（3）去除琼脂。液体培养基具有通气培养、振荡培养的优点。

1.2.3  培养基中加入消毒剂。（1）抗生素。王亦菲等[3]在彩色海芋的组织培养中，发现200mg/L青霉素，可以有效抑制内生菌的生长;朱光廉[4]发现2g/L苯菌灵和2g/L链霉素，可以对相思树的芽和茎段起到很好的灭菌效果;邢东方等[5]使用150mg/L头孢霉素，抑制枣在组织培养中的污染;刘占彬等[6]以多花黑麦草种子为外植体的组织培养中，在培养基中添加70mg/L制霉菌素、10mg/L氨苄西林钠和0.1%次氯酸钠，可以很好地控制污染。（2）其他。许婉芳等[7]发现金线莲在含多菌灵的培养基中生长健壮无污染;李英慧等[8]发现稀释5000倍液的75%百菌清，可有效防治青霉菌污染苹果试管苗。

1.2.4  培养基的分装与灭菌。培养基要趁热倒入玻璃容器中，注意不要漏在容器口或壁上，立即用封口膜封口，以免杂菌污染。

（1）高压蒸汽灭菌法，使用时要保证灭菌锅内部清洁，内部的冷气排尽，装填的灭菌物避免堆放过满，保持灭菌锅温度在121℃20min，且培养基应在24h内及时灭菌，以免菌类大量繁殖严重污染培养基。

（2）过滤灭菌。对一些在高压条件下不稳定或易分解的药品，如GA3、IAA等必须经过过滤灭菌的方法进行灭菌处理，将灭菌后的药液加入到经过高压灭菌的凝固前4～50℃的培养基中，使用的过滤器等必须经过高压灭菌。

培养基灭菌结束后取出待冷却，一般观察2～3d无污染现象后方可使用，最好在2周内使用。

1.3   外植体

1.3.1  外植体的选择与预处理。（1）采集前预先培养。通常田间材料较温室材料带菌多，温室材料较水培材料带菌多，所以对污染较严重的田间材料，可提前修剪、套袋或改为室内培养或水培，带菌严重的外植体采集前，一般先噴洒杀虫剂或杀菌剂。（2）取材的年龄、大小、部位。植物体的各个部位几乎都可以用来组织培养，其中植物胚不易污染且具有幼嫩的分生组织细胞，茎尖遗传性稳定，病毒含量低，胚和茎尖是较好的外植体。一般说来，体积大的材料较体积小的材料带菌多。孟杨等以湖北百合不同大小的鳞片为外植体进行组织培养发现，大的鳞片的污染率高于小的。（3）取材的季节和时间。取材的最佳时间在3d连续晴朗天气的某下午，取材季节在3～5月最佳，在材料休眠末期或萌动前，取外植体较为合适，此时，材料积累了丰富的营养物质和内源激素，且病菌还未到活跃期。汤诗杰等[9]在南京椴组织培养中发现3～4月污染控制容易，6～7月污染控制较为困难;王吉凤等[10]在芍药组织培养中发现2月、8～10月污染最高，4月污染最低;7～10月、1～2月是高温多雨季节，高温多雨的环境有利于污染的发生;8月和9月是牧草虫的大量繁殖阶段，极易严重污染组培。（4）采集后的预处理。从室外采集回来的材料，用擦过酒精的剪刀剪除多余的枯枝黄叶，洗去泥土，用洗洁精或肥皂水清洗表面，用软毛刷清洗材料表面，然后用自来水冲洗1～2h。

1.3.2  消毒处理（无菌操作台上）。对已污染的较为珍贵或稀少的培养物，可切取离污染菌较远的部分重新消毒接种。

2     无菌操作阶段

2.1   准备室、接种室、培养室消毒

在每次接种前都必须彻底消毒准备室、接种室和培养室，常用的消毒溶液有70%酒精和2%的新洁尔灭溶液。接种前后，都要用70%酒精擦洗超净工作台，70%酒精喷雾喷洒门窗、地面和墙壁，及时打扫卫生，接种前，要开紫外灯2～40min，关闭后3～60min进入操作。

2.2   操作

操作前，修剪过长指甲，用洗洁精清洗双手，带上手套和口罩，用70%的酒精擦洗手套且在操作中经常擦洗，换上干净固定的拖鞋和工作服。操作过程中，转接瓶与被转接瓶应紧挨酒精灯，手尽量避免在器皿上方晃动，接种时，镊子避免触到瓶口，并在下风方向操作，养成良好的卫生习惯，避免走动引起菌雾，接种时避免说话、随意走动，手不要离开操作台，中间不停地用酒精擦洗，接种前，用酒精浸泡接种用的工具，灼烧后冷却备用，防治交叉污染，接种过程中工具要不停的蘸酒精灼烧。

3     培养阶段

移植培养室光照前可以进行一段时间的黑暗处理或低温处理。

培养期间保持培养室的清洁以免引起细菌和霉菌污染，一般每周用高锰酸钾（3～6g/m3）和甲醛（4～6mL/m3）熏蒸1次。李文凯等[11]发现用苍术熏蒸的灭菌效果维持的时间较长，且与紫外线照射和甲醛熏蒸无显著差异，关键是对人体无刺激和副作用。已污染的培养瓶要及时用高压灭菌，防止病菌污染培养室里其他培养瓶。

4     结语

随着社会的进步科技的发展，植物组织培养技术得到了广泛的应用。控制污染问题变得尤为重要。所以，必须加强研究分析，对引起植物组织培养中污染的原因要提高认识，采取必要措施进行预防和控制，保证培养物正常生长发育。

参考文献

[1]宋峰惠，李康，史彦江.阿月浑子组织培养及快速繁殖技术研究[J].新疆农业科学，2002（6）

[2]周俊辉，周厚高，刘花全.植物组织培养中的内生细菌污染问题[J].广西植物，2003（1）

[3]邢东方，尚霄丽，冯建灿.枣组织培养中抗生素对污染的抑制作用[J].经济林研究，2010（1）

（责任编辑   张芝）