固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法同时测定银耳中的8种农药残留

姚清华 李 捷 柯秋璇 颜孙安 林 虬

(1.农业农村部农产品质量安全风险评估实验室(福州)福建福州 350003；2.福建省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所福建福州 350003；3.福建出入境检验检疫局技术中心福建福州 350001)

银耳(TremellafuciformisBerk)有“菌中之冠”的美称，为我国著名传统食药兼用真菌[1-4]。病虫害是影响银耳产量和品质的重要因素。银耳栽培中常见的病害是绿色木霉(Trichodermaviride)、青霉(Penicillium)、浅红酵母菌(RhodotorulapallidLodd)、链孢霉(NeurosporasitophilaShear et Dadge)，虫害则多为螨虫、菇蚊、线虫等[5-7]。银耳病虫害防治方法通常是在正式栽培前，通过对空菇房喷施农药来进行预防的。吡虫啉、啶虫脒、异丙威、丁硫克百威、克百威、甲胺磷、乙酰甲胺磷和咪鲜胺为银耳中常见的防治病虫害的农药种类。

目前，关于银耳中农药残留的分析，仅少量文献报道了银耳中单一农药及其代谢物残留的高效液相色谱[8，9]或气相色谱[10]分析方法，但未涉及多种农药残留的同时检测。液相色谱-串联质谱法集高效分离、高灵敏度、多组分定性与定量于一体的优点[11-16]。本文以乙酸乙酯提取银耳样品，可以同时分析银耳中的8种常见农药残留量，且样品前处理净化步骤简单、适用性广。方法经大量实际银耳样品的检测分析验证，具有快速、准确、稳定的优点，对其它食用菌中多种农药残留的同时检测也可提供参考和借鉴。

1 实验部分

1.1 仪器及试剂

Agilent 1200高效液相色谱仪、Agilent 6460三重四极杆质谱仪(美国，Agilent公司)；SYNERY UV超纯水器(美国，Millipore公司)；IKA-MS3漩涡振荡器(德国，IKA公司)；HN200氮吹仪(济南海能仪器股份有限公司)；TDL-40B离心机(上海安亭科学仪器厂)。

吡虫啉(Imidacloprid)、啶虫脒(Acetamiprid)、异丙威(Isoprocarb)、丁硫克百威(Carbosulfan)、克百威(Carbofuran)、甲胺磷(Methamidophos)、乙酰甲胺磷(Acephate)、咪鲜胺(Prochloraz) 8种标准物质均购自农业部环境保护科研监测所，均为100 μg/mL。正己烷、乙腈、乙酸乙酯(色谱纯，美国赛默飞世尔科技有限公司)，NaCl(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；PSA和GCB固相萃取填料(美国Agilent公司)；C18固相萃取填料(美国Welch Material公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液配制移取吡虫啉、啶虫脒、异丙威、丁硫克百威、克百威、甲胺磷、乙酰甲胺磷、咪鲜胺8种标准物质各1.00 mL(100 μg/mL)于10 mL容量瓶中，配制成10.0 μg/mL的混合标准储备溶液，使用时以空白基质溶液稀释成适当浓度的基质标准工作液，临用现配。

1.2.2 样品提取与净化称取5 g(精确至0.01 g)样品，加入1 g NaCl，准确加入20 mL乙酸乙酯，涡旋振荡30 s后，超声提取30 min，4 000 r/min离心5 min后，将4 mL上清液转移至另一个试管中，分别加入100 mg PSA、100 mg C18和50 mg GCB固相萃取填料，涡旋振荡30 s，4 000 r/min离心5 min后，准确移取2 mL上清液氮吹至干，1 mL 30%乙腈水溶液定容，过0.22 μm有机滤膜后，待进样分析。

1.2.3 液相色谱-三重四极杆质谱条件色谱条件：Phenomenex Luna C8色谱柱(150 mm×2.0 mm，3.0 μm)；流动相：A为0.1%甲酸-5 mmol/L NH4Ac溶液，B为乙腈。梯度洗脱程序：初始为30%B，保持0.5 min；0.5～3 min，90%B；3～6 min，保持90%B；6～9 min，30%B，保持3 min。流速：0.3 mL/min；进样量：5 μL；柱温：40 ℃。质谱条件：多反应监测(MRM)模式检测；毛细管电压：3 500 V；气帘气温度：325 ℃；气帘气流速：8 mL/min；鞘气温度：340 ℃；鞘气流速：12 mL/min。8种待测农药的保留时间、母离子、特征离子碎片、碰撞能量及保留时间见表1。

表1 8种农药的LC-MS/MS分析参数Table 1 LC-MS/MS parameters for eight pesticides

*quantitative ion pairs.

2 结果与讨论

2.1 样品前处理方法的优化

2.1.1 提取方式选择本实验分别采用乙腈、乙酸乙酯、乙酸乙酯+正己烷(50+50)对银耳中的8种目标农药进行提取，各农药的回收率见图1。结果表明，采用乙酸乙酯提取效果最好，8种农药的回收率均在70%～120%之间，乙酸乙酯+正己烷(50+50)对甲胺磷和乙酰甲胺磷的提取回收率仅为20%左右，而乙腈对丁硫克百威的提取回收率不到30%，故选取乙酸乙酯为提取溶剂。

2.1.2 净化方法选择本实验使用QuChERS方法净化，对比了C18、GCB和PSA 3种固相萃取填料，发现GCB对咪酰胺，PSA对甲胺磷和乙酰甲胺磷有强吸附作用，使用这两种固相萃取填料作为吸附剂，相应农药的回收率较低，结果见图2。使用C18固相萃取填料净化，8种农药的回收率均能达到理想值。比较净化效果，发现C18能显著降低丁硫克百威、吡虫啉、咪酰胺等农药的基质效应，故选择C18作为固相萃取吸附材料。

图1 不同提取溶剂对银耳中8种农药的提取效率Fig.1 Extraction efficiencies of 8 pesticides with different extraction solvents

图2 不同净化方法条件下银耳中8种农药的回收率Fig.2 Recoveries of 8 pesticides with different purification method

2.2 基质效应的考察

基质成分和目标化合物在电喷雾离子源进行离子化时会存在竞争关系，包括基质增强效应和基质抑制效应[11]。通常基质工作曲线和标准工作曲线斜率比值在85%～115%之间不存在基质效应。实验以银耳为基体，通过配制相应线性范围内的标准工作曲线和基质工作曲线，对银耳中农药残留分析检测进行基质效应考察。结果表明，银耳中吡虫啉、啶虫脒、克百威、咪酰胺、异丙威的基质工作曲线的斜率为标准工作曲线斜率的85%～115%之间，但是丁硫克百威、甲胺磷、乙酰甲胺磷的基质工作曲线的斜率为标准工作曲线斜率的40%～50%，故采用基质工作曲线来对8种农药残留进行定量。

2.3 色谱与质谱条件的优化

图3 8种农药标准溶液(20 μg/L)(a)及空白样品加标(20 μg/kg)(b)的总离子流(TIC)色谱图Fig.3 TIC chromatograms of eight pesticides standard(20 μg/L)(a) and spiked blank sample(20 μg/kg)(b)Left to right:peak 1,acephate;peak 2,methamidophos;peak 3,imidacloprid;peak 4,acetamiprid;peak 5,carbofuran;peak 6,isoprocarb;peak 7,prochloraz;peak 8,carbosulfan.

实验以0.1%甲酸溶液作为流动相A，乙腈为流动相B，采用梯度洗脱方式洗脱，对8种农药的准分子离子峰进行二级质谱分析，分析碎片离子信息，选择2～3对响应值高、基线噪音值低的离子对作为定性离子对，选择其中信号最强的定性离子对作为定量离子对。进一步对液相色谱条件进行优化，发现当采用0.1%甲酸和5 mmol/L NH4Ac溶液替代含0.1%甲酸溶液作为流动相A后，连续对混合标准溶液进样，目标物的线性范围均较大且峰面积的相对标准偏差(RSD)均较小，故将流动相A改为含0.1%甲酸-5 mmol/L NH4Ac溶液。甲胺磷和乙酰甲胺磷保留时间相近，不能较好的分离，但是本文采用多反应监测(MRM)模式进行定性定量，方法具有良好的选择性，克服了甲胺磷和乙酰甲胺磷定量结果间的相互影响。8种农药的总离子流色谱图见图3。

2.4 方法评价

2.4.1 线性范围、检出限和定量限将不同浓度的混合农药标准溶液进行高效液相色谱-串联质谱分析，以峰面积(Y)与对应目标物浓度(X，μg/mL)绘制标准曲线，8种目标农药的线性回归方程和相关系数见表2。在空白样品中添加不同浓度的含8种目标物的标准溶液，按优化条件进行测定，分别以3倍和10倍信噪比(S/N)计算方法的检出限和定量限，结果亦列于表2。

2.4.2 方法准确度和精密度在空白银耳样品中分别添加20、100、200 ng/mL 3个不同质量浓度的待测组分混合标准溶液，按优化后的条件重复测定6次。银耳样品中8种农药的加标回收率及相对标准偏差(RSD)如表3所示。银耳中添加不同水平8种农药的回收率为70.1%～106.4%，RSD为3.97%～13.68%。方法具有良好的回收率和精密度，能够满足银耳中8种农药残留量的分析要求。

表2 8种农药的线性方程、相关系数、检出限和定量限Table 2 Linear equations,correlation coefficients,limits of detection(LOD) and limits of quantitation(LOQ) of eight pesticides

表3 方法的加标回收率及精密度(n=6)Table 3 Recoveries and relative standard deviations(RSDs) of eight pesticides(n=6)

2.5 方法的应用

用本文建立的方法对132份银耳样品进行检测，人员及实验室间比对结果表明该方法重现性好，稳定、可靠。其中，15份样品检出吡虫啉，15份样品检出克百威，4份样品检出异丙威，3份样品检出乙酰甲胺磷，2份样品检出甲胺磷，2份样品检出啶虫脒，2份样品检出咪鲜胺，但残留量较低。

3 结论

建立了同时测定银耳及其栽培料中吡虫啉、啶虫脒、异丙威、丁硫克百威、克百威、甲胺磷、乙酰甲胺磷和咪鲜胺8种农药的高效液相色谱-串联质谱分析方法。该方法样品前处理净化步骤简单，快速、准确、重现性好，适用于银耳中多农药残留的检测。