二烯丙基二硫下调TGF-β1/Rac1通路抑制人胃癌细胞β-catenin表达

苏 波，丁 恩，曾 颖，夏 红，刘 芳，苏 琦

(1.南华大学药学与药理学研究所，湖南省高校药物蛋白质组学重点实验室，湖南 衡阳 421001；2.南华大学肿瘤研究所, 湖南省胃癌研究中心，湖南省高校肿瘤细胞与分子病理学重点实验室，湖南 衡阳 421001；3. 湖南省中医药专科学校附属医院肿瘤科，湖南 株洲 412012)

转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)诱导肿瘤细胞由上皮细胞向间质细胞转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)。信号通路之间相互作用可促进TGF-β1诱导EMT。Rac1通路介导TGF-β1诱导前列腺癌细胞EMT[1]。Rac1促进Wnt3a激活ST2细胞β-catenin[2]。

二烯丙基二硫(diallyl disulfide，DADS)通过干预多条信号通路抑制肿瘤细胞增殖与侵袭。我们之前报道，DADS下调Rac1通路可抑制胃癌细胞EMT[3]；DADS下调β-catenin表达与其抑制胃癌细胞EMT有关[4]；DADS通过上调miR22下调Wnt-1表达，抑制胃癌细胞侵袭与迁移[5]。

本实验观察DADS对TGF-β1诱导Rac1和β-catenin表达的影响，探讨DADS抑制胃癌细胞EMT是否通过TGF-β1/Rac1通路下调β-catenin表达。

1 材料与方法

1.1 细胞培养人胃癌MGC803细胞株由南华大学肿瘤研究所保存，用含10%小牛血清的RPMI1640培养基培养，置于37 ℃，5% CO2、饱和湿度的培养箱。

1.2 试剂DADS 购自Fluka公司，将其与Tween-80按1 ∶2比例溶解，再用生理盐水稀释100倍，储存于-20 ℃冰箱备用。人重组TGF-β1(R&D Systems，USA)；小牛血清(杭州四季青生物工程公司)，RPMI1640培养基(Gibco公司)；Total RNA Kit(Omega公司)，RT试剂盒(Invitrogen公司)，PCR试剂(Promega公司)；BCA蛋白定量试剂盒(Promega公司)；TGF-β1、Rac1、β-catenin抗体购自Abcam公司，E-cadherin和vimentin购自Cell Signaling Technology公司，β-actin抗体、二抗、ECL发光试剂盒购自Santa Cruz公司；TGF-β1受体阻断剂SB431542和Rac1抑制剂NSC23766购自Cayman Chemical公司。

1.3RT-PCR使用Total RNA Kit提取细胞总RNA后，用RT试剂盒逆转录成cDNA。设计扩增引物，使用试剂盒进行PCR。TGF-β1： F 5′-TCT CCA GGC ATT TCC ACT ATT C-3′，R 5′-CTC AGG CAT TCG TCA ACA TCT A-3′；Rac1：F 5′-TGC CTG CTG TTG TAA ATG TCT C-3′，R 5′-AAA GTT CAG TGC TCG GTG TTC T-3′；β-catenin：F 5′-GGA AGG GAC AGT ATC GTT TGT T-3′，R 5′-GCC TCA GCA TCT ACC AGC ATA G-3′；E-cadherin：F 5′-CTC CCA ATA CAT CTC CCT TCA C-3′，R 5′-CGC CTC CTT CTT CAT CAT AGT AA-3′；vimentin：F 5′-GCG AGG AGA GCA GGA TTT CT-3′，R 5′-TCT TGT AGG AGT GTC GGT TGT T-3′; β-actin: F 5′-CTG GGA CGA CAT GGA GAA AA-3′，R 5′-AAG GAA GGA TGG AAG AGT GC-3′。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，用BIO-RAD成像系统拍照，AlphaImager 2200软件扫描，以β-actin为内对照，计算相对光密度值。

1.4Westernblot将收集的细胞置于细胞裂解液中，冰上放置30 min后，12 000 r·min-1离心10 min，提取上清液，BCA法测定蛋白浓度。蛋白样本经10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移至PVDF膜，膜封闭1 h后孵育一抗，4 ℃过夜。用TBST洗膜，二抗孵育1 h，洗膜后用ECL发光，X片显影、定影。

2 结果

2.1 DADS下调TGF-β1表达用30 mg·L-1DADS处理胃癌MGC803细胞0、12、24、48 h，分别检测TGF-β1 mRNA和蛋白水平。如Fig 1A所示，与0 h组比较，TGF-β1 mRNA水平呈时间依赖性下降(P<0.05)；同时，TGF-β1 蛋白水平降低(P<0.05)，其下降趋势与mRNA一致(Fig 1B)。以上结果表明，DADS下调TGF-β1基因表达。

Fig 1 Effect of DADS on expressionof TGF-β1 in MGC803

*P<0.05vs0 h

2.2 DADS通过下调TGF-β1抑制Rac1表达为了研究DADS下调TGF-β1是否抑制Rac1表达，我们首先观察TGF-β1对Rac1表达的影响。如Fig 2所示，用TGF-β1(5 μg·L-1)处理胃癌MGC803细胞24 h后，Rac1 mRNA和蛋白水平上调(P<0.05)。

用TGF-β1(5 μg·L-1)+SB431542 (10 μmol·L-1)处理细胞，观察阻断TGF-β1受体对Rac1表达的影响。与TGF-β1处理组比较，TGF-β1+SB431542组和TGF-β1+DADS组Rac1 mRNA和蛋白表达下调(P<0.05)(Fig 2)，表明TGF-β1受体阻断剂可抑制TGF-β1诱导Rac1表达，DADS可通过下调TGF-β1抑制Rac1表达。同时，TGF-β1(5 μg·L-1)+NSC23766(50 μmol·L-1)处理组Rac1的表达下调(Fig 2)，提示Rac1阻断剂NSC23766对Rac1表达也具有抑制作用。

Fig 2 Down-regulation of TGF-β1 byDADS on expression of Rac1 in MGC803

1: control; 2: DADS; 3: TGF-β1; 4: TGF-β1+SB431542;5: TGF-β1+DADS; 6: TGF-β1+NSC23766;*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsTGF-β1

2.3 DADS通过下调TGF-β1/Rac1抑制β-catenin表达如Fig 3所示，用TGF-β1(5 μg·L-1)处理胃癌MGC803细胞24 h后，β-catenin mRNA和蛋白水平上调(P<0.05)。与TGF-β1处理组比较，TGF-β1+SB431542组Rac1和β-catenin表达下调(P<0.05)(Fig 3)。

Fig 3 Down-regulation of TGF-β1/Rac1 by DADSon expression of β-catenin in MGC803

1: control; 2: DADS; 3: TGF-β1; 4: TGF-β1+SB431542;5: TGF-β1+DADS; 6: TGF-β1+NSC23766;*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsTGF-β1

为了确定TGF-β1是否通过Rac1上调β-catenin表达，用TGF-β1(5 μg·L-1)+NSC23766(50 μmol·L-1)处理细胞，观察阻断Rac1对TGF-β1诱导β-catenin表达的影响。与TGF-β1处理组比较，TGF-β1+NSC23766组β-catenin表达下调(P<0.05)(Fig 3)，表明Rac1可介导TGF-β1上调β-catenin。

与TGF-β1处理组比较，TGF-β1+DADS组Rac1和β-catenin表达下调(P<0.05)(Fig 3)，以上结果表明，DADS通过下调TGF-β1/Rac1抑制β-catenin表达。

2.4 阻断TGF-β1/Rac1通路上调E-cadherin表达如Fig 4所示，与对照组比较，用TGF-β1(5 μg·L-1)处理胃癌MGC803细胞24 h后，E-cadherin mRNA和蛋白水平下降(P<0.05)；用DADS(30 mg·L-1)处理细胞24 h后，E-cadherin mRNA和蛋白表达水平增加(P<0.05)。

与TGF-β1处理组比较，TGF-β1+DADS组E-cadherin mRNA和蛋白表达水平增加(P<0.05)(Fig 4)。SB431542和NSC23766可抑制TGF-β1下调E-cadherin mRNA和蛋白表达(P<0.05)(Fig 4)。上述结果表明，DADS抑制TGF-β1/Rac1通路可上调E-cadherin 表达。

2.5 阻断TGF-β1/Rac1通路下调vimentin表达如Fig 5所示，与对照组比较，用TGF-β1(5 μg·L-1)处理胃癌MGC803细胞24 h后，vimentin mRNA和蛋白水平增加(P<0.05)；而DADS(30 mg·L-1)处理细胞24 h后，vimentin mRNA和蛋白水平较对照组明显降低(P<0.05)。

与TGF-β1处理组比较，TGF-β1+SB431542组和TGF-β1+NSC23766组vimentin mRNA和蛋白水平下降，DADS的作用与SB431542和NSC23766类似(P<0.05)(Fig 5)。结果表明，DADS可通过抑制TGF-β1/Rac1通路下调vimentin 表达。

3 讨论

TGF-β1通过其受体激活下游信号通路诱导EMT，从而促进肿瘤细胞侵袭和迁移。TGF-β1上调vimentin、下调E-cadherin，诱导胃癌细胞EMT[6]。本研究证实，DADS下调TGF-β1表达，且可抑制TGF-β1对vimentin和E-cadherin表达的影响，提示DADS可能通过影响TGF-β1下游信号通路抑制胃癌细胞EMT。

我们之前报道，DADS下调Rac1通路和β-cate-nin可抑制胃癌细胞EMT[3，4]。TGF-β1可诱导肝脏星形细胞Rac1表达[7]。本研究发现，TGF-β1上调胃癌细胞Rac1和β-catenin表达，提示TGF-β1不仅通过其受体激活Rac1和β-catenin信号通路，还可能通过上调Rac1和β-catenin基因表达增强信号通路传导。TGF-β1受体阻断剂SB431542可逆转TGF-β1诱导食管癌细胞EMT[8]。我们的研究结果显示，DADS和SB431542抑制TGF-β1上调Rac1和β-catenin表达，表明DADS抑制TGF-β1诱导胃癌细胞Rac1和β-catenin表达。此外，我们发现Rac1抑制剂NSC23766抑制TGF-β1诱导Rac1表达。文献报道，NSC23766减少肺上皮细胞释放TGF-β1、抑制EMT，表明Rac1调节TGF-β1表达[9]。我们分析，Rac1与TGF-β1之间可能存在正反馈的调节机制，NSC23766可能抑制内源性TGF-β1表达，从而削弱外源性TGF-β1诱导的Rac1表达。

Fig 4 Down-regulation of TGF-β1/Rac1 by DADSon expression of E-cadherin in MGC803

1: control; 2: DADS; 3: TGF-β1; 4: TGF-β1+SB431542;5: TGF-β1+DADS; 6: TGF-β1+NSC23766;*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsTGF-β1

Fig 5 Down-regulation of TGF-β1/Rac1 by DADSon expression of vimentin in MGC803

1: control; 2: DADS; 3: TGF-β1; 4: TGF-β1+SB431542;5: TGF-β1+DADS; 6: TGF-β1+NSC23766;*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsTGF-β1

Rac1与Wnt/β-catenin通路之间存在相互作用。在结肠癌细胞，Rac1募集β-catenin进入核内，增强T细胞因子和淋巴增强因子1介导的基因转录[10]。在乳腺癌细胞，Rac1抑制剂可下调Wnt/β-catenin通路的活性，抑制细胞迁移与侵袭[11]。我们分析，TGF-β1上调胃癌细胞Rac1有助于β-catenin的激活，而DADS抑制TGF-β1诱导Rac1表达可能导致β-catenin活性下调，与其上调vimentin、下调E-cadherin、抑制EMT有关。

Rac1介导β-catenin激活可上调滋养层细胞Snail和MMP9表达，而下调Rac1表达可使β-catenin表达和活性下降，提示Rac1不仅调节β-catenin的活性，也能上调β-catenin表达[12]。ERK介导TGF-β1上调β-catenin表达、诱导肾小管上皮细胞EMT[13]。TGF-β1通过Rac1激活ERK、诱导角质细胞EMT[14]。我们之前报道，DADS下调Rac1[3]和ERK通路[15]。本研究发现，NSC23766抑制TGF-β1上调胃癌细胞β-catenin表达。我们分析，Rac1/ERK通路可能介导TGF-β1上调β-catenin，DADS可通过抑制TGF-β1/Rac1通路下调β-catenin表达。

综上所述，DADS抑制TGF-β1上调vimentin、下调E-cadherin，同时DADS下调Rac1和β-catenin 表达。TGF-β1受体阻断剂和Rac1抑制剂可抑制TGF-β1诱导β-catenin 表达。上述研究表明，TGF-β1通过Rac1通路上调β-catenin 表达； DADS抑制胃癌细胞EMT可能与下调TGF-β1/Rac1通路和β-catenin 表达有关。