小檗碱调节PI3K/AKT/FOXO1/Bim信号通路改善高糖诱导的足细胞损伤

刘 青，汪佳佳，胡亚琴，唐丽琴,2，魏 伟

(1. 安徽医科大学临床药理研究所，抗炎免疫药物教育部重点实验室，抗炎免疫药物安徽省协同创新中心，安徽 合肥 230032；2. 中国科学技术大学附属第一医院(安徽省立医院)药剂科，安徽 合肥 230001)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)最严重的微血管并发症之一[1]。这种疾病是由于伴随持续高血糖和DM状态下的血流动力学因素，导致肾小管、肾小球或肾间质的损害[2]。DN的主要病理特征是肾小球结构肥大、肾小球基底膜增厚、肾小管间质扩张以及细胞外基质成分(如胶原蛋白和纤连蛋白)的异常积聚[3]。足细胞是终末分化的上皮细胞，其形成交叉的足突，构成肾小球滤过屏障，是阻止蛋白质渗漏的关键组分。足细胞损伤、去分化和丢失是DN的病理标志[4]。足细胞凋亡是DN的早期病理表现，因此足细胞凋亡可能在DN病理机理中起到关键作用[5]。PI3K/Akt/FOXO信号通路在细胞存活和凋亡中起到了重要作用，FOXO被Akt在Thr24、Ser256、Ser319上磷酸化，促进它们的出核转运和转录激活[6]。越来越多的证据表明FOXO1具有抑癌作用，因为它在多种癌症中具有抗增殖和促凋亡活性[7]。小檗碱(berberine，BBR)是从黄连中提取的天然化学物质，BBR具有多种生物学和药理学活性，包括抗肿瘤、抗炎和抗氧化应激作用，BBR也被证明具有抗糖尿病作用[8]。研究证明小檗碱能明显改善高糖诱导的足细胞损伤[9]，因此本实验的目的是探讨BBR通过调节PI3K/AKT/FOXO1/Bim信号通路改善高糖诱导的足细胞损伤，为临床DN的治疗打下基础。

1 材料

1.1 细胞小鼠肾小球足细胞株(BNCC 337685)，购于北京北纳创联生物技术研究院。

1.2 药物BBR由安徽省立医院药剂科药学实验室提取纯化，经RP-HPLC法检测纯度大于96.5 %。精密称取40.365 g BBR粉末，加入10 mL生理盐水，加热涡旋混匀至完全溶解，配制成浓度为1.2×104μmol·L-1的BBR储备液，用0.22 μm无菌过滤器过滤除菌后冷冻保存。使用前加热溶解，稀释到所需浓度即可用于实验。

1.3 试剂细胞计数试剂盒(CCK-8，货号K1018)，美国Protech公司；RPMI 1640培养液(货号：11875)，Thermo Fisher科技公司；凋亡试剂盒(货号AP101)：联科生物公司；胎牛血清：Biological Industries公司；六孔细胞培养板，Corning公司；WT-1(Rabbit Antibody，货号sc-19232026)，Santa Cruz生物科技公司；PI3K(Rabbit Antibody，货号4249)、AKT(Rabbit Antibody，货号4691S)、p-AKT(Rabbit Antibody，货号4060S)、FOXO1(Rabbit Antibody，货号2880)、p-FOXO1(Rabbit Antibody货号9461)、Bim(Rabbit Antibody，货号2933)，Cell Signaling公司；nephrin(Rabbit Antibody，货号ab85379)，Abcam公司。

1.4 仪器电泳仪(型号DYY-10)：北京六一仪器厂；可调水平摇床(型号STS-1)：上海琪特分析仪器有限公司； PH检测计(型号PHS-3C)：上海雷磁仪器厂；酶标仪(型号BioTek Elx×808)，美国BioTek公司；纯水仪(型号HB-RO/05)：杭州惠邦净水设备有限公司；Eppendorf Research plus 移液器(型号31200000)：Eppendorf科技公司；化学发光成像分析仪(型号Image Quant Las 4 000 mini)，美国 GE Healthcare Life Sciences公司。

2 方法

2.1 细胞培养将液氮中冻存的细胞于37 ℃水浴中融解离心，在RPMI 1640基础培基中加入10% FBS、1% 双抗、0.2% γ干扰素用于培养细胞，细胞于5% CO2、37 ℃的细胞培养箱中培养。

2.2 CCK-8检测取指数生长期的肾小球足细胞进行实验，96孔培养板加入足细胞单细胞悬液200 μL/孔(约含一万个细胞)，各组另设5个平行组；待细胞贴壁完全后，正常对照组(Control，11.1 mmol·L-1葡萄糖)、高糖模型组(HG，30 mmol·L-1葡萄糖)和BBR给药组按照分组给予对应的培基，BBR给药组的浓度设置为：15、30、60、90、120 μmol·L-1。给药24 h后，CCK-8溶液的用量为10 μL/孔。培养板避光继续培养，每隔1 h用酶标仪震荡后测定各组在450 nm处的吸光度，一次实验结果取平均值，重复实验3次。

2.3 细胞凋亡采用Annexin V- FITC/PI双染实验观察小檗碱对高糖诱导足细胞凋亡的影响，足细胞贴壁后分为5组，按照分组给予对应的培基，BBR给药组浓度设置为：30、60、90 μmol·L-1，给药24 h后，消化离心并收集1×105～5×105个细胞。接着每管先加入500 μL稀释5倍的Binding buffer，再加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI溶液，室温静置避光孵育5 min后转移到流式管中，流式细胞仪上机检测。

2.4 Transwell小室检测细胞迁移能力将Transwell小室放于24孔板中，下室分组及加药处理同2.3项，并加入15%血清的RPMI 1640培养基，上室每孔加入一万个5% FBS的RPMI 1640培养基的足细胞单细胞悬液，培养箱中培养24 h后，用5% 结晶紫染色，用PBS洗去多余的结晶紫，用棉签擦去Transwell上室未迁移的细胞，在倒置显微镜下拍照并观察结果。每个样本随机选取5个视野，计算每个视野的细胞数。

2.5 Western blot检测相关蛋白表达足细胞消化计数后按1×108/孔加到6孔板上，细胞贴壁后分组及加药处理同2.3项，培养箱培养24 h，用预冷的PBS轻柔洗涤两次去除死细胞及杂质后，每孔加入100 μL现配的预冷裂解液，置冰上30 min后刮下细胞，离心收集上清液，加入蛋白上样缓冲液，得到上样蛋白。在配好的SDS-PAGE凝胶上用微量注射器上样，然后完成跑胶、转膜、封闭步骤，用目的蛋白抗体孵育过夜，3遍TPBS洗膜后将PVDF膜于适合浓度的二抗工作液-牛奶中37 ℃孵育1 h；显影后进行灰度图分析得结果。

3 结果

3.1 BBR对足细胞增殖的影响Fig 1结果显示，高糖模型组与正常对照组相比，足细胞的存活率明显降低(P<0.01)；BBR(30、60、90 μmol·L-1)作用组与高糖模型组相比，能明显促进足细胞增殖。因此后续实验选择了BBR 30、60、90 μmol·L-1这3个浓度进行实验。

Fig 1 Effect of BBR on proliferation of

##P<0.01vscontrol group:*P<0.05,**P<0.01vsHG group.

3.2 BBR对足细胞凋亡率的影响Fig 2结果显示，高糖模型组与正常对照组相比，足细胞的凋亡率有较明显提高(P<0.01)；BBR(30、60、90 μmol·L-1)作用组与高糖模型组比较能明显降低足细胞的凋亡率。

Fig 2 Effect of BBR on apoptosis of

##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsHG group.

3.3 BBR对足细胞迁移能力的影响Fig 3结果表明，高糖模型组与正常对照组相比， Transwell下室的足细胞数量明显增加(P<0.01)；BBR(30、60、90 μmol·L-1)作用组与高糖模型组相比，Transwell下室的足细胞数量明显减少。

Fig 3 Effect of BBR on migration of

##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsHG group.

3.4 BBR对高糖作用后足细胞相关蛋白表达的影响PI3K/AKT/FOXO1/Bim信号通路被认为是细胞存活和凋亡的重要调控因子。Fig 4结果显示，与正常对照组相比，高糖模型组中足细胞上PI3K、p-AKT和Bim蛋白表达量明显升高(P<0.01)，p-FOXO1的蛋白表达量明显降低(P<0.01)，并且BBR(30、60、90 μmol·L-1)作用组能够有效降低足细胞上PI3K、p-AKT和Bim蛋白表达水平，能够有效升高足细胞上p-FOXO1蛋白表达水平。

3.5 BBR对足细胞标志蛋白表达的影响维持足细胞功能完整性的重要蛋白有nephrin、WT-1。Fig 5的Western blot的灰度值结果显示，高糖模型组与正常对照组相比，nephrin、WT-1蛋白表达量明显降低(P<0.01)，与高糖模型组相比，BBR(30、60、90 μmol·L-1)作用组的nephrin和 WT-1蛋白表达量明显升高。

Fig 4 The expression levels of Bim,PI3K/β-actin and

##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsHG group.

Fig 5 The expression levels of nephrin and WT-1 tested

##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsHG group.

4 讨论

足细胞是肾小球基底膜选择性通透性屏障的关键组成部分，DM诱导的足细胞凋亡导致肾小球滤过屏障功能减弱，这可能导致蛋白尿的发生[10]。足细胞通过狭缝隔膜连接并覆盖肾小球基底膜的表面以调节渗透性。它包裹毛细血管形成过滤缝，可以保持肾小球滤膜的结构完整性，足细胞丢失是导致包括糖尿病肾病在内的一些肾病进展的关键因素。在DN期间，由于足突的丧失，足细胞在高血糖症中发生脱离。WT-1和nephrin是维持细胞骨架的重要分子，细胞骨架在足细胞损伤过程中被下调，此外，结蛋白是另一种细胞骨架蛋白，在足细胞损伤过程中会上调。在本研究中，我们使用30 mmol·L-1葡萄糖成功建立了足细胞损伤模型，正如WT-1和nephrin的下调所证明[11]。

哺乳动物叉头盒O(FOXO)家族包括四个成员：FOXO3，FOXO4，FOXO6和FOXO1。 FOXO成员在多种细胞功能中发挥重要作用，如肿瘤抑制、糖尿病并发症、细胞周期停滞、DNA修复、伤口愈合、免疫、代谢调节和细胞分化，FOXO1是一种转录因子，在氧化应激、细胞代谢、增殖和凋亡中起重要作用，并且有证据表明FOXO1的表达与丝氨酸/苏氨酸激酶Akt信号传导途径有关，FOXO1是AKT的下游基因[12]。FOXO转录因子受上游PI3K/Akt磷酸化级联调节，其中FOXO1在肾损伤的发病机理中起重要作用，并且FOXO1从细胞质转移至核激活，p-FOXO1的增加将减少FOXO1的核转位，抑制凋亡基因Bim的表达，防止细胞凋亡的发生[13]。BBR是一种从黄连中分离出来的异喹啉生物碱，BBR具有多种药理活性，如降低血糖和抗氧化应激，抑制炎症，因此BBR是DN治疗中的潜在治疗药物[14]。本实验在体外用高糖刺激足细胞，并使用不同浓度的BBR观察BBR缓解足细胞损伤的机制，通过观察足细胞的凋亡、迁移、足细胞相关蛋白的表达、足细胞上PI3K/AKT/FOXO1/Bim信号通路的蛋白表达，得出BBR在高糖环境下可以降低足细胞的凋亡率、减少足细胞迁移、提高足细胞标志性蛋白的表达，并且可以有效降低高糖环境下足细胞上PI3K、p-AKT和Bim蛋白表达水平，有效升高足细胞上p-FOXO1蛋白表达水平，从而改善足细胞的损伤。

综上所述，高糖环境激活PI3K/AKT信号通路，进而影响了FOXO1从细胞质转移至核被磷酸化，未被磷酸化的FOXO1促进凋亡基因Bim的表达，促进足细胞的凋亡，实验结果显示，BBR能调节此过程。因此，本实验揭示了BBR可能通过调节PI3K/AKT/FOXO1/Bim信号通路改善高糖诱导的足细胞损伤。