军曹鱼催乳素受体PRLR1基因的克隆及其在不同盐度条件下mRNA 表达差异

黄宝松 李金凤 张野 曹丹煜 卢晓颖 陈刚 王忠良

（广东海洋大学水产学院，湛江 524088）

催乳素（Prolactin，PRL）是一种由内分泌器官腺垂体前叶分泌的多效单链多肽类激素，于1928年被Stricker和Grneter验证该激素具有使假阳性妊娠母兔分泌乳汁的功能，并命名为催乳素。国内外研究结果证实了催乳素的生理功能不单单是生殖和泌乳，还包括调节水盐平衡、胰岛细胞分化、脂肪代谢、增强非特异性免疫、刺激肠道加速钙的吸收等［1-2］。研究显示，催乳素通过与其受体蛋白—催乳素受体（Prolactin receptor，PRLR）结合，启动信号级联，利用JAK激酶和信号传导子及转录激活子（Janus kinase-signal transducer and activator of transcription，JAK-STAT）在靶细胞上介导其生理功能，主要的信号蛋白为JAK2和STAT［3-4］。PRLR是跨膜受体蛋白，属于I类细胞因子受体超家族。大量的研究证实了PRLR在哺乳动物中存在多种亚型，可分为长链PRL、中长链PRL和短链PRL，主要差异为长度和胞内段的组成。而在硬骨鱼类中则存在两种PRLR基因，是硬骨鱼类特有的现象。据报道，莫桑比克罗非鱼存在PRLR1和PRLR2两种PRL受体亚型［5］。目前，已在多种硬骨鱼类上克隆出PRLR的全长序列，如尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）、黑鲷（Acanthopagrus schlegelii），并且利用不同激素刺激转染细胞或直接体内注射，证实两种亚型的PRLR都能启动下游信号通路，说明这两种亚型PRLR都是PRL 的特异性受体［6-7］。

广盐性鱼类适应不同盐度的过程中受神经内分泌调节系统调控，主要作用在渗透压调节器官，如鳃、肠和体肾等［8］。Pavlosky等［9］发现莫桑比克罗非鱼（O. mossambicus）在海水中血浆渗透压和PRLR2鳃组织mRNA表达量均高于淡水实验组，而PRL和NKAaα1a、PRLR1鳃组织mRNA表达量则低于淡水实验组，提示PRL、PRLR1参与了鱼类适应淡水生活的生命活动。王杰［2］将尖鳍鲤（Cyprinus acutidorsalisWang）急性胁迫48 h 后，在鳃、肠、肾、肝、性腺、脑、脑垂体、脾及皮肤等组织中均能检测到PRLR的mRNA，其中，在鳃中表达量最高。同样的，在黑鲷的鳃、肠、肾、肌肉、性腺、心脏、肝脏、胃、脾脏及脑垂体中也检测出PRLR的存在，且表达规律相似［10］，说明PRLR在各个组织中均有分布，除渗透压调节外，可能参与多项生理活动的调控。

军曹鱼（Rachycentron canadum）又名海鲡，隶属鲈形目（Perciformes）、军曹鱼科（Rachycentridae）、军曹鱼属（Rachycentron），为广盐性、中型肉食性洄游鱼类［11］。军曹鱼广泛分布于热带和亚热带海域，包括大西洋、印度洋和太平洋。其生长速度快，肉质鲜美，营养价值高，是具有食用价值的重要海水经济鱼类。军曹鱼养殖多以海水网箱为主，受台风、暴雨等极端天气影响，海水盐度波动较大，对军曹鱼的生长和存活造成了一定的影响。目前在其他硬骨鱼类盐度适应过程中PRL和PRLR的表达模式的研究较多，而军曹鱼的较少。因此，为探究军曹鱼适应高盐和低盐水体的渗透压调节机制，本实验克隆了PRLR1cDNA，并通过荧光定量PCR（qRT-PCR）检测了PRLR1在健康组织中的mRNA表达丰度和分别适应高盐、低盐后的表达规律，为研究军曹鱼盐度适应渗透压调节机制奠定分子理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及试剂 实验用鱼（军曹鱼）采自于广东海洋大学东海岛海洋生物研究基地，挑选出规格一致，健康有活力，体表无损伤的军曹鱼幼鱼，测得平均体长为18.35±1.75 cm，平均体重为60.53±8.21 g。试验前暂养于室内1.5立方水体的水桶，使用正常盐度（30‰）的过滤海水，水温为27±2℃。暂养1周后，挑选健康个体，剖取鳃、肠、体肾、脑及心脏等8个组织，迅速置于液氮中速冻，3 h后移至-80℃冰箱保存。

总RNA提取试剂盒TransZol Up Plus RNA Kit、反转录试剂盒EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix、胶回收试剂盒EasyPure Quick Gel Extraction Kit均购自北京全式金生物有限公司，SYBR®Select Master Mix购自聚研生物科技有限公司（广州），SMARTer®RACE 5'/3' Kit、DH5α 感受态细胞、pMD18-T Vector、LA-Taq DNA聚合酶购自大连宝生物有限公司。引物均由上海生工生物工程公司合成。

1.1.2 慢性盐度适应实验 盐度实验设置3个盐度梯度，分别为10‰、30‰和35‰，其中以30‰组为对照组。将暂养7 d后的军曹鱼分为3组，每组设3个重复，放置10尾军曹鱼。使用淡水或高品质海水晶将养殖用水以每天调低或调高5个盐度，直到实验组盐度达到要求后开始实验。养殖采取静水充气方式，每日投喂6%体重的石斑鱼配合饲料，换水率为30%。养殖4周后，各盐度下随机挑选5尾军曹鱼，分别采取鳃、肠、体肾3种组织，立即放入液氮中速冻，3 h后移至-80℃冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 总RNA的提取与cDNA第一链合成 参照RNA提取试剂盒的说明书，以军曹鱼幼鱼的鳃丝为材料，提取总RNA后，使用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测完整性，超微量核酸蛋白测定仪测定浓度，-80℃保存。参照反转录试剂盒说明书，使用1 μg总RNA合成cDNA第一链，-20℃保存。

1.2.2 军曹鱼PRLR1基因的克隆 通过实验室已有的转录组数据，筛选出注释为PRLR的unigene，经NCBI数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）BLAST比较，确定为鱼类PRLR1基因片段。根据比较结果，选取保守区域设计特异性引物（表1）进行扩增。其 中，PRLR-F1、PRLR-F2、PRLR-R1和PRLR-R2用来克隆中间片段，PCR程序设计为95℃预变性5 min；95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，循环35次；72℃延伸5 min。PCR产物使用1.5%的琼脂糖凝胶分离出目的条带，转化连接，挑选阳性单克隆菌落进行测序。根据测序得到的中间片段序列设计3'和5'末端巢式PCR引物（分别为3'-F1、3'-F2、5'-R1和 5'-R2）（表 1）。先以 3'-F1和 Long primer、5'-R1和Long primer配对扩增，程序设计为95℃预变性5 min；95℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸90 s，循环35次；72℃延伸10 min。产物稀释2倍后作为模板进行第二次扩增，引物为3'-F2和Short primer、5'-R2和Short primer。程序设计为95℃预变性 5 min；95℃变性30 s，62 /67℃退火 30 s，72℃延伸60 s/30 s，循环35次；72℃延伸10 min。PCR产物切胶回收、连接、转化。最终，挑选出单菌落送上海生工生物工程公司测序。

1.2.3 生物信息学分析 将测序结果导入DNAMAN软件，拼接后得到PRLR1基因的全长cDNA序列。经NCBI数据库的分析工具ORF Finder（https：//www.ncbi.nlm. nih.gov/orffinder/）预测，获得完整的军曹鱼PRLR1开放阅读框（ORF）和氨基酸序列。利用TMHMM Server2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）预测跨膜螺旋域。利用signalP-5.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）预测信号肽。使用SMART网站（http：//smart.embl-heidelberg.de/）在线预测蛋白质结构和功能。从NCBI数据库中下载同源氨基酸序列，运行ClustalX1.83进行氨基酸序列多重比较和同源性分析。使用MEGAX软件以领接法（neighbor-joining method，NJ）构建系统进化树。

表1 实验所用引物

1.2.4PRLR1基因的组织差异表达和盐度适应后PRLR1基因的表达分析 根据PRLR1基因cDNA序列，设计特异性引物qPRLR-F、qPRLR-R（表1），扩增长度为199 bp；以军曹鱼β-actin基因为内参。qRT-PCR扩增反应在实时荧光定量扩增仪（Roche light CyclerTM 96）中进行，使用SYBR®Select Master Mix试剂盒检测PRLR1基因在鳃、肠、体肾、脑、胃、肌肉、脾脏和心脏等8个组织的表达丰度和盐度适应后PRLR1基因在鳃、肠及体肾等渗透压相关器官的表达丰度。扩增程序设计为：95℃预变性10min；95℃变性 10 s，60℃退火 20 s，72℃延伸 20 s，循环40次。每个样品重复检测3次以减少误差。运用2-ΔΔCt方法计算PRLR1基因的相对表达量，使用SPASS19.0对实验数据进行单因素方差分析。

2 结果

2.1 PRLR1基因全长cDNA序列的克隆和氨基酸序列分析

根据测序结果拼接结果，得到军曹鱼PRLR1基因cDNA序列（GenBank序列登录号为MN080491），全长有2 629 bp，开放阅读框ORF有1 953 bp，编码650个氨基酸（图1）。其中，5'UTR大小为248 bp，3'UTR大小为427 bp。细胞外区的4个半胱氨酸，分别位于37、47、76和87位氨基酸上。利用TMHMM Server2.0预测跨膜螺旋域，结果显示第1-234个氨基酸为膜外段，第235-257个氨基酸存在跨膜螺旋域，第258-650个氨基酸为膜内段。利用signalP-5.0预测信号肽，发现PRLR1信号肽为第1-25个氨基酸，剪切位点为第25-26个氨基酸。通过SMART预测功能结构域，结果显示PRLR1氨基酸序列含有2个纤维连接蛋白3型结构域（Fibronectin type 3 domain，FN3）（29-113 aa、128-214 aa）。

2.2 PRLR1基因的氨基酸序列同源比较和系统进化分析

氨基酸序列同源比较结果如图2。Blast结果显示：军曹鱼PRLR1与大黄鱼（Larimichthys crocea）、大刺鳅（Mastacembelus armatus）和金钱鱼（Scatophagus argus）同源性最高，分别为76.95%、74.89%和74.88%。此外，与黑棘鲷、尼罗罗非鱼、虹鳟（Oncorhynchus mykiss）、大西洋鲑（Salmo salar）的同源性分别为73.66%、68.48%、55.45%和55.95%；使用MEGAX软件构建进化树，结果显示：军曹鱼先与邻近鲈形目的大刺鳅在物种进化上聚为一支，距离最近；其次与大黄鱼、黑棘鲷和金钱鱼等聚为一支；人（Homo sapiens）和小鼠（Mus musculus）、鸟类绿头鸭（Anas platyrhynchos）和红原鸡（Gallus gallus）分别聚为一支，与军曹鱼关系较远（图3）。

2.3 PRLR1组织表达分析

qRT-PCR组织表达结果显示，PRLR1基因在军曹鱼的各个组织中均有表达，其中鳃表达量最高；其次是肌肉、体肾和肠，而在胃、脾、脑和心脏中则微量表达（图4）。

2.4 不同盐度下军曹鱼PRLR1的组织表达分析

高盐（30‰）和低盐（10‰）适应4周后，军曹鱼PRLR1基因在鳃、肠、体肾的表达情况如图5所示。结果显示，高盐适应后，PRLR1基因在鳃中表达量最高（为对照组1.49倍，显著差异，P＜0.05），肠次之，体肾最少；对照组中，PRLR1基因在鳃中表达量最高，体肾次之，肠最少；低盐适应后，PRLR1基因同样在鳃组织中表达量最高（为对照组0.06倍，极显著差异，P＜0.001），在肠、体肾中微量表达。其中，随着盐度下降，PRLR1基因的在鳃、肠、体肾中表达量均逐渐下降。PRLR1基因在对照组和低盐组的肠组织的表达量均低于体肾，而在高盐组则相反，表现为肠表达量高于体肾。

3 讨论

PRLR1是I类细胞因子受体超家族中重要成员，与PRL结合后，形成激素受体三聚合体复合物，进而激活PRLR1和细胞内酪氨酸激酶的磷酸化，在鱼类渗透压调节中发挥着重要的信号传导作用［10］。本研究利用RACE技术成功克隆出军曹鱼的PRLR1全长cDNA序列，其中包含1 953 bp的ORF，编码650个氨基酸，具有脊椎动物PRLR的基本特征。相对于有较大差异的细胞内区，脊椎动物PRLR细胞外区保守性较高，其C端包含了由4个保守的半胱氨酸构成的2个二硫键以及由W-S-X-W-S（X为差异氨基酸）构成的WS区［12］。细胞内区作为受体偶联启动信号级联的关键部位，在鱼类中存在着不同长度和组成，相似度不高，仅有2个相对保守区域，分别为box1和box2。box1是由靠近跨膜区的8个富含脯氨酸的疏水残基组成的，其形成的SH3折叠（SrC kinase homology domain3）是信号转换分子特异识别位点。box2由疏水残基、带负电荷和正电荷的残基组成，在鱼类和哺乳动物中保守性比box1小［13］。军曹鱼的PRLR1除存在二硫键和WS区外，同样含有box1。在斜带石斑鱼［14］、黑棘鲷中PRLR1也存在WS区和box1，运行ClustalX软件对军曹鱼与其他物种进行氨基酸序列同源比较，结果显示，军曹鱼PRLR1的WS区和box1确实在鱼类和哺乳动物上高度保守，说明PRLR1的WS区和box1结构域在鱼类和哺乳动物进化上相对保守。系统进化树结果也显示，军曹鱼PRLR1与鲈形目的大刺鳅、大黄鱼等聚为一支，与人、小鼠等哺乳动物较远，这与物种进化过程规律相符，进一步说明本研究中PRLR1属于鱼类PRLR家族成员。

图1 军曹鱼PRLR1基因cDNA序列及氨基酸序列

图2 军曹鱼PRLR1氨基酸序列多重序列比对分析

图3 军曹鱼PRLR1氨基酸序列聚类分析

广盐性鱼类能适应较大范围盐度的水环境，主要与其渗透压调节器官有关，如鳃、肠、体肾和皮肤等。其中，鳃作为广盐性鱼类的主要渗透压调节器官之一，已有大量文献证实其渗透压调节能力与鱼鳃中的氯细胞和Na+/K+-ATPase酶密切相关，其中，氯细胞进行Na+、Cl-离子的运输，Na+/K+-ATPase酶为其运输离子提供动力。鱼在外界水环境盐度由低渗转向高渗时，鳃丝结构与生理功能存在显著性差异。中华鲟在盐度为15的半咸水中驯养60 d后，鳃丝和鳃小片中氯细胞数量显著超过淡水驯化组，其细胞体积膨大，这与氯细胞排出过量的Na+、Cl-以辅助鱼体适应高渗环境的特征相适应［15］。在施氏鲟（Acipenser schrenckii）［16］、马苏大马哈鱼（Oncorhynchus masou）［17］、美洲鲥（Alosa sapidissima）［18］中也有类似的研究结果。鱼类PRLR通过与催乳素结合，可以抑制Na+/K+-ATPase酶活性、缩小氯细胞，达到稳定鱼体渗透压的目的［19］。军曹鱼PRLR1组织分布结果显示，其在鳃、肠、体肾、肌肉、胃、脾、脑和心脏中都有分布，其中主要分布在鳃、肠和体肾等渗透压调节器官，鳃表达量最高，肌肉次之，这与虹鳟、金头鲷（Sparus aurata）、金鱼（Carassius auratus）等鱼类PRLR1表达规律相似［20-22］，说明军曹鱼PRLR1基因主要功能为渗透压调节，且主要作用场所在鳃上，同时也暗示了PRLR1参与其他生理活动的调节。

在硬骨鱼类中，人们普遍认为PRL和生长激素（GH）在盐度适应过程中共同参与渗透压调节，前者适应低盐水体，后者适应高盐水体。研究表明，在急性盐度胁迫中，褐牙鲆（Paralichthys olivaceus）、日本鳗鲡（Anguilla japonica）的血浆中PRL浓度与外部渗透压呈负相关，而GH呈正相关［23-24］。从达里湖（半咸水）中洄游到贡格尔河（淡水）的瓦氏雅罗鱼（Leuciscus waleckii），其血清中PRL含量显著上升，而GH含量显著下降［25］。此外，有研究表明在不同鱼类中，PRL的调节能力表现出了种属差异，如PRL在大马哈鱼淡水适应过程中并没有产生显著影响［26］。在体外实验中，鳃和垂体中的受体受PRL和环境渗透压刺激后，均产生差异反应：受PRL刺激后PRLR1表达量升高［27］，而增加细胞外渗透压则促使PRLR2表达量升高［28］。因此，PRL对渗透调节的作用可能受到激素水平和环境渗透压共同调控。本研究结果中同样发现了军曹鱼PRLR1基因经低盐适应后，在鳃、肠、体肾中mRNA表达量皆显著性上调，而在高盐适应中表达量变化规律均呈逐步下降趋势，且在肠和体肾中微量表达。低盐组、正常组和高盐组中，PRLR1基因的表达量均为鳃组织最高，肠次之，体肾最低。类似的研究结果可见于尖鳍鲤［2］、金钱鱼［29］。由以上结果推测，PRLR1基因能调节鱼体渗透压稳态，且鳃组织为PRLR1的主要作用场所，在军曹鱼适应低盐度环境中起到重要作用。

图4 军曹鱼PRLR1各组织相对表达量

图5 盐度适应后军曹鱼PRLR1各组织相对表达量

4 结论

本研究首次克隆出军曹鱼PRLR1基因全长cDNA，该基因全长为2 629 bp，包含1 953 bp的开放阅读框ORF，共编码650个氨基酸。通过多重序列比对发现，军曹鱼PRLR1基因与鲈形目鱼类相似性高，都含有WS区和box1等标志性结构域。该基因在多个组织中均有表达，其表达水平鳃最高，肌肉、肠和体肾次之。在盐度适应中，鳃、肠、体肾中PRLR1表达量随着盐度的降低而升高，与对照组差异显著。