常温常压等离子诱变结合玉米秸秆水解液驯化酿酒酵母生产生物乙醇

陈胜杰，高翔，袁戎宇

(广东怡和科洁科技有限公司，广东 佛山， 528000)

酿酒酵母是一种单细胞真菌，能将糖发酵成酒精和CO2，分布于整个自然界，是一种典型的兼性厌氧微生物，是一种天然发酵剂[1]。玉米秸秆含有丰富的纤维质原料及可利用的化学成分，含有30%以上的碳水化合物、2%～4%的蛋白质和0.5%～1%的脂肪，秸秆是一种具有多用途的可再生的生物资源[2]。每年有50%以上的玉米秸秆被农民焚烧，既浪费资源，又污染了环境。玉米秸秆可经过水解处理后，可释放丰富的发酵型降解寡糖和单糖，作为二代燃料乙醇的重点研发原料，具有巨大的市场和政策红利[3]。

经典的玉米秸秆处理方法是先经稀酸高温预处理，然后投放水解酶水解得到水解液，其中含有较多的副产物，如糠醛、乙酸[4]等，使其后期的微生物发酵生产环节受到影响，菌株发酵效率降低[5]。为了解决此类问题，研究者提出了许多改进措施，如陈尚妍等[6]通过增加预处理时秸秆干物料比重，增加处理效率；朱艳等[7]通过减少稀硫酸的浓度，提高预处理温度同时缩短预处理时间，避免副产物的过多产生；李小娟等[8]通过诱变及驯化等手段提高工程菌对糠醛、乙酸的耐受力，从而减少抑制物对发酵产量的影响。

本文主要以超酒酵母xp为出发菌，通过采用常温常压等离子诱变技术(atmospheric and room-temperature plasma mutagensis，ARTP)获得突变体库，并以含有定量抑制物糠醛和乙酸的YPD培养基进行初筛，通过多代驯化，逐步增加培养基中抑制物浓度，最终达到和玉米秸秆水解液中抑制物浓度相同水平，筛选出能适应玉米秸秆水解液中副产物浓度的酿酒酵母。相比于传统诱变方法，利用ARTP有效造成种类丰富的DNA损伤，突变库容量大且正突变率高，且ARTP 诱变育种技术操作简便、安全无毒[9]。本实验结果将为后续的规模应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试剂

YPD液体培养基(g/L)：蛋白胨20，酵母粉10，葡萄糖20，固体培养基需另加2%琼脂，均购自国药集团化学试剂有限公司。

玉米秸秆水解液，来自我司水解产物，经检测，内含主要可发酵性糖类(g/L)为：葡萄糖60，木糖20；主要抑制物浓度(g/L)为：糠醛3.78，乙酸1.6。玉米秸秆，网购自山东聊城。

初筛抑制培养基(g/L)：50%玉米秸秆水解液的抑制物浓度，即含有糠醛1.85、乙酸0.8的YPD琼脂培养基。

酿酒酵母xp，本实验室菌种保藏室提供。其他试剂，均购自市售门店。

1.2 仪器与设备

ARTP生物诱变仪，北京思清源生物科技有限公司；Biorad Aminex HPX-87H 有机酸分析柱和C18柱，美国菲罗门公司；恒温摇床，天津欧诺仪器仪表有限公司；SW-CJ型洁净工作台，苏州安泰；752型分光光度计，上海菁华科技；高效液相色谱仪，美国安捷伦；生化培养箱，广东医疗器械厂；微量移液器，美国Effendorf；96孔板酶标仪，美国Biotek Epoch；SBA-40E生物传感仪，山东省科学院生物研究所。

1.3 试验方法

1.3.1 突变体库的建立

采用ARTP技术获得突变体库，条件为：在 15 W紫外灯下，距离30 cm 照射85 s，致死率在92%左右，得到的菌株突变体库性能优良，突变率高[10]。

1.3.2 初筛培养

以初筛培养基对ARTP突变体库进行初筛，挑选长势好、大小适中的单菌落。

1.3.3 驯化条件及改造菌的获得

共计挑选96株单菌落，于96孔板上培养，初代培养液为液体初筛培养基，每孔装液量100 μL， pH 6.0，培养温度32 ℃，24 h后得到一代种子液；

按5%的接种量将一代种子液转接入新鲜培养基中，培养条件同上，得到二代。并重复培养至第25代种子液；每转接一代，培养液中的糠醛浓度增加0.076 g/L，乙酸浓度增加0.032 g/L，依次递增。并在100%的玉米水解液中转接3代，得到稳定的驯化菌。用96孔板酶标仪测量96株驯化菌的OD600值，挑选生物量较高的5株菌，分别记作xp1、xp2、xp3、 xp4、xp5。

1.3.4 改造菌生物学性能检测

生长曲线以细胞干重为准，采用752型分光光度计检测菌体OD600值，根据公式换算得到。在不含抑制剂的YPD液体培养基中，分别对5株突变驯化菌和原始菌进行培养，每2 h取样检测生物量，并绘制生长曲线；葡萄糖浓度检测采用SBA-40E生物传感仪检测。

以下成分均用高效液相色谱法进行，且均采用外标法和峰面积积分法测定。乙醇检测条件如下：Biorad Aminex HPX-87H 色谱柱，柱温50℃，流动相为5 mmol/L H2SO4，流速为0.6 mL/min，RID检测器35℃[11]；糠醛的检测条件为：C18柱，流动相为V(乙睛)/V()0.1%乙酸)=10∶90，柱温30 ℃，流速1.0 mL/min，波长277 nm[12]；乙酸的检测条件为：Biorad Aminex HPX-87H 色谱柱，柱温30 ℃，流动相为5 mmol/L H2SO4，流速为0.5 mL/min，紫外检测波长215 nm，采用二元梯度分析[13]；木糖的检测条件为：采用Biorad Aminex HPX-87H 色谱柱，柱温55 ℃，流动相为5 mmol/L H2SO4，流速为0.6 mL/min，RID检测器温度35 ℃[14]。

得到各成分浓度后，换算相应的指标，具体如下：

糖醇转化率YE/S(g/g)=乙醇max/耗糖量；乙醇平均得率Q(g/(L·h))=乙醇max/发酵时间；ΔYE/S/%=(YE/S-xpi/YE/S-原菌)×100；ΔQ/%=(Qxpi/Q原菌)×100；ΔDCW/%(DCW-xpi/ DCW-原菌)×100[15]；菌体生长曲线时均采用菌体干重数值，对应关系为：DCW=0.260 2×OD600+0.658 8，R2=0.990 7。其中， xpi指各改造菌。

2 结果与分析

2.1 驯化菌的生长曲线

由图1可知，5株改造菌进入对数期和平稳期的时间更快，在6 h左右摆脱延迟期进入对数期，22 h左右进入稳定期，比原菌分别提早10 h和16 h(原菌14 h左右进入对数期，38 h左右进入稳定期)，且改造菌稳定期持续时间为20 h，比原菌增加了4 h。另外，在菌体生物量方面，进入稳定期后，xp1、xp2、xp4的菌体数均高于原菌， xp5菌体数与原菌基本持平，xp3菌体略低于原菌，其中xp2的DCW值为最高的3.71，比原菌的3.12提高了18.9%。

图1 各菌株生长曲线图Fig.1 Growth curve of each strains

2.2 改造菌发酵上清液的各项成分检测

结合之前测菌体生长曲线的数据，将各菌株的发酵时间调整到48 h，培养基为100%的玉米秸秆水解液，发酵结束后离心得到上清液，并检测各成分含量，具体结果见表1。

表1 发酵过程中各成分质量浓度 单位：g/L

由表1可知，5株改造菌的葡萄糖均在32 h左右耗尽，并且少量消耗木糖，其中xp2的木糖消耗最多，仅6.5 g。说明改造菌的碳源喜好与原菌相差不大，均优先利用葡萄糖作为碳源。改造菌的葡萄糖消耗速率明显快于原菌(见图2-a)，说明改造菌的糖转运和消化系统得到显著提升。5株改造菌的最高乙醇浓度表现各有不同，其中xp2浓度最高，为38.7 g/L，乙醇浓度增高的有xp2、xp3和xp5，三者在抗抑制物方面也表现出了较好的抗性，均能更好转化和降低主要副产物糠醛和乙酸等(见图3)，这也是改造菌能更快的生长的因素之一。

由图3可知，发酵结束时，各改造菌的上清液中糠醛和乙酸等副产物浓度均有不同程度的减少，证明改造菌对抑制物的降解转运能力有所提升，抵抗能力增强。其中，xp2菌株的糠醛残留量为1.43 g/L，相比出发菌降低了62.17%，乙酸残留1.21 g/L，相比出发菌降低了26.67 %

2.3 改造菌各参数指标的变化

由表2和图4可知，5株改造菌的发酵参数指标相比原菌均有不同程度的变化，其中xp2菌株的各项参数均有提升，乙醇平均得率相比原菌提高了27.7%。糖醇转化率方面，xp2和xp5均有不错的提升，相对原菌分别提高了17.1%和6.44%；细胞干重方面除了xp3菌株外，其他4株菌有不同程度的提升，菌株生长能力是后续乙醇积累的前提，足量的活菌更能实现乙醇的有效积累。

3 讨论

本文旨在通过ARTP诱变技术联合玉米秸秆水解液驯化方式，得到能够适应玉米秸秆水解液环境的

a-过程中葡萄糖浓度变化曲线;b-过程中木糖浓度变化曲线;c-过程中乙醇浓度变化曲线图2 发酵过程中的木糖、葡萄糖和乙醇的浓度变化Fig.2 Changes in the concentration of ethanol, xylose and glucose during fermentation

图3 发酵结束时上清液中糠醛和乙酸等副产物的浓度Fig.3 Concentration of byproducts such as furfural and acetic acid in the upper liquid at the end of fermentation

表2 改造菌发酵结束后各参数指标的变化Table 2 Changes of parameters of modified strains after fermentation

图4 改造菌的各参数值相对于原菌的变化情况Fig.4 Changes of parameters of modified strains after fermentation

改造菌株，提高菌株性能。本实验得到了最优表现型菌株xp2，株挑选菌中有2株在糖醇转化率、乙醇平均得率和生物量方面均高于原菌，其正向突变率接近40%左右。其中，xp2的生长速率较原始菌有明显提高，22 h进入稳定期，比原菌(36 h)缩短到了14 h，缩减比例达到了38.89%。并且在此基础上细胞干重也较原菌提高了19.68%，乙醇平均得率提高了27.7%，糖醇转化率提高了17.1%。葡糖糖和木糖的消耗量和利用效率也有显著提高，且改造菌对糠醛转化能力明显提高，对乙酸的转化能力也有一定程度的提升。其中，乙醇平均收率高达0.806 g/(L·h)，与ZHANG等[16]报道的效率基本持平(其发酵周期为96 h)。通常酵母菌培养周期在2～7 d[17]，此次改造菌的生长速率提升，将有效缩短生长周期，提高生产效率，降低成本。ARTP技术能高效突变原始菌，使其发生不定项突变，获得优质的突变体库，然后通过进一步的驯化，提高其转化降解抑制物，诸如糠醛，香草醛等的能力，达到抗抑制的目的。

本实验仍有需要完善之处，如玉米秸秆的预处理方式对水解液的副产物成分有直接的影响作用，后期可以更多的在优化预处理方式方面寻找突破口，如采用热水预处理[18]，蒸汽暴破法[19]，超临界CO2萃取法[20]等手段降低副产物的形成；另外，改造菌对糠醛的转化虽然有一定提高，但发酵上清液中残留的糠醛浓度仍较高(1.43 g/L)，其对菌体的毒害作用仍不容忽视，同样的情况也表现在乙酸的转化方面，改造菌对乙酸的消耗基本忽略不计，加上发酵过程菌株自身代谢产生的乙酸，其毒害抑制作用仍存在。

4 结论

本文以超酒酵母xp为出发菌株，通过常温等离子诱变(ARTP)技术，得到突变体库，并以玉米秸秆水解液为筛选压力，经过多代连续传代，梯度增加抑制物浓度，驯化培养突变株，最终筛选出能够在玉米秸秆水解液中高产酒精的改造菌xp2，其菌体生物量DCW最高为3.71 g/L，较原菌的3.10 g/L上升了19.68%，生长对数期为6～22 h，稳定期为22～42 h，比原菌的对数期明显提前，稳定期持续时间延长4 h，生长性能优势明显；发酵上清液中的糠醛1.43 g/L，乙酸1.21 g/L，较出发菌株发酵上清液的糠醛3.78 g/L，乙酸1.65 g/L，分别降低了62.17%和26.67%，表明改造菌转化糠醛和乙酸的能力较原菌有明显提升；乙醇收率和平均得率分别为38.7 g/L和0.806 g/(L·h)，较出发菌株分别提高了17.72%和27.71%。本实验筛选得到的xp2菌株具备一定的工业应用价值，对后续的研究提供一定的借鉴意义。