不同杀青温度对绿茶香型形成的影响

汪蓓，舒娜，陆安霞，廖雪利，闫敬娜，谢关华，童华荣

(西南大学 食品科学学院，重庆，400715)

香气作为评价茶叶品质的标准之一，一直以来都是国内外的研究重点[1-10]。杀青是绿茶初制中的特有环节，对绿茶香气形成有重要影响，杀青过程中，鲜叶中的青味物质向花香，甜香等物质转变，构成绿茶多样的香型[11]。目前，已有许多关于杀青工艺对绿茶香气影响的研究[12-13]。赵飞等[14]研究表示，不同杀青方式茶样的糖苷前体含量在总量和单个组分上均有显著差异。HAN等[15]研究表示，杀青能促进茶叶中类胡萝卜素香气前体和脂肪酸类香气前体的降解，促进绿茶香气形成。孙慕芳等[16]对同一原料制得的信阳毛尖茶和蒸青绿茶香气成分进行分析，发现信阳毛尖香气成分相对含量大于蒸青绿茶。因杀青温度对绿茶香气形成具有重要意义，本研究设置不同杀青温度进行绿茶加工，对制得茶样进行定量描述分析(quantitative descriptive analysis, QDA)，运用主成分分析(principal components analysis, PCA)对香气属性得分与绿茶样品的相关性进行研究，采用气相色谱质谱联用技术(gas chromatograph mass spectrometer, GC-MS)对样品挥发性化合物进行检测，并计算化合物气味活性值(odor activity value, OAV)探究不同杀青温度制得绿茶的香气差异，以期为不同香型绿茶杀青温度选择提供一定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

茶鲜叶原料：巴渝特早 (CamelliaSinensis(L.) O. Kuntze cv.BayuTezao)，一芽一叶，2018年9月采于重庆市巴南区。

C8～C23正构烷烃混合物(99%),美国Supelco公司；癸酸乙酯(99%),美国Sigma公司；1-辛烯-3-醇(98%)、α-萜品醇(98%)、β-环柠檬醛(95%)、苯甲醇(98%)、苯甲醛(99%)、苯乙醇 (98%)、橙花醇(98%)、橙花醛(98%)、丁酸叶醇酯(98%)、芳樟醇(98%)、己醛(98%)己酸己酯(98%)、(Z)-己酸-3-己烯酯(99%)、顺式茉莉酮(95%)、水杨酸甲酯 (99%)、香叶醇(98%)、氧化芳樟醇(呋喃型)(97%)、氧化芳樟醇(吡喃型)(98%)、(Z)-3-己烯-1-醇(98%)、乙酸丁酯(99%)、乙酸叶醇酯(98%)正戊醇(99.5%),日本TIC株式会社； NaCl(分析级),重庆科隆化学试剂公司。

1.2 仪器与设备

手动SPME进样器和50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头，美国 Supelco 公司；气相质谱联用仪QP2010 P1us，日本岛津公司；超纯水发生器，美国Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

采摘巴渝特早一芽一叶，按照“摊放→杀青→揉捻→干燥”的方法加工成绿茶。杀青温度分别为 270、320、370 ℃，样品分别编号为D、Z、G；3个不同杀青处理叶在相同条件下分别进行揉捻、干燥；干燥所得成品茶粉碎后密封。鲜叶采用液氮固样，冷冻干燥后粉碎密封。样品均置于-40 ℃冰箱保存备用，每个样品重复取样3次。

1.3.2 定量描述分析

参考GB/T 16291.1—2012《感官分析 选拔、培训与管理评价员一般导则 第一部分：优选评价员》对11名西南大学茶学专业学生进行嗅觉敏感度筛选，建立7人评价小组；小组成员经讨论得出描述词及其参比物，建立参比体系；评价小组对表1中各描述词进行强化记忆，尺度训练。样品制备和呈送参照LEE等[17]的方法；采用定量描述分析对各香气性质强度进行评价，强度尺度为0～7，0代表感觉不到，7代表香气极强，每个样品重复3次，结果取平均值，参比体系如表1。

表1 香气描述词及参比物Table 1 Definition and strength of aroma properties

注：香叶醇、(Z)-3-己烯-1-醇均先溶于少量甲醇，再用超纯水稀释至相应浓度；配制好的参比物均在置于100 mL带塞锥形瓶中进行嗅闻

1.3.3 挥发性化合物萃取

准确称取样品1.000 g和2.000 g NaCl置于40 mL装有磁力搅拌子的萃取瓶中，加5 mL煮沸的去离子水，迅速加盖密封置于60 ℃水浴条件下，插入萃取头，平衡5 min，萃取55 min，进样口解吸5 min。每个样品重复3次。

1.3.4 GC-MS分析条件

GC条件：色谱柱为DB-5MS(30 m×0.25 mm， 0.25 μm)石英毛细管柱；升温程序：初始温度40 ℃，保持2 min，以3 ℃/min升到85 ℃，保持2 min，以2 ℃/min升到110 ℃，保持2 min，以3 ℃/ min升到230 ℃，保持2 min；载气为氦气(纯度>99．999 %)；流速1.0 mL/min；压力：50.5 kPa；进样口温度230 ℃；不分流进样模式；进样时间1 min。

MS条件：电子离子源；电子能量70 eV；离子源温度230 ℃；接口温度230 ℃；扫描范围m/z40～400；真空系统为分子涡轮泵。

1.3.5 挥发性化合物定性定量分析

定性方法：保留匹配度大于80的化合物，运用NIST08.LIB和NIST08s.LIB标准谱库对GC-MS质谱数据进行检索，参考VANDENDOOL等[18]的方法，利用正构烷烃(C8～C23)测量计算保留指数(retention index，RI) 结合文献报道保留指数对比定性。

定量方法：外标法定量，取一系列已知浓度梯度的香气标准品，在相同的条件下检测，取得标准曲线方程和回归系数R2如表2所示，用以计算样品中的香气化合物含量。表2中未列出化合物采用癸酸乙酯的标准曲线进行计算。

表2 挥发性化合物标准曲线Table 2 Standard curves of volatile compounds detected in tea samples

OAV按公式(1)计算[19]:

(1)

式中：Ci为挥发性成分i的含量；OTi为挥发性成分i在水中的香气阈值。

1.3.6 统计分析

运用IBM SPSS Statistics 25进行单因素方差分析 (ANOVA)，P<0.05 认为存在显著性差异；采用SIMCA 14.1进行主成分分析，方差贡献率累计大于85%时认为所选主成分能反映指标原始信息。

2 结果与分析

2.1 不同杀青处理定量描述分析结果

茶的香气品质是茶叶挥发性物质的种类和含量的综合效应[20]，茶叶香型的改变能在一定程度上反应挥发性化合物的变化。审评人员根据筛选的7个香气属性对不同杀青温度处理的茶样进行香气感官评价，其结果如表3所示。不同杀青温度制得茶样在花香、青草气、清香、甜香属性上差异显著，而在煮板栗香、嫩香属性上得分不显著(P<0.05)。D在青草气属性中得分显著高于Z、G两处理，而在花香、煮板栗香、豆香及甜香上得分较低；Z处理在甜香属性上显著高于D、G两处理，G处理在花香分属性上得分显著高于D、Z两处理，且在清香、板栗香、豆香上得分最高。此外，各处理在豆香、板栗香属性上得分虽未表现出显著差异，但D、Z、G三处理在这些香气属性上得分均呈上升趋势。倪德江等[12]报道、随着杀青程度增加，茶叶香气形成显著，与本研究结果一致。

表3 定量描述分析审评结果Table 3 The mean intensity values for the 3 samples of aroma profile based on QDA

注：不同上标字母表示不同样品同种属性之间具有显著性差异(P<0.05)

2.2 感官审评结果PCA分析

本研究以成品茶样品和鲜叶及感官审评得分作为分析对象，采用主成分分析法对感官属性进行分析，以更加直观地对香气属性和各茶样之间的关系进行表征。主成分结果显示，前2个主成分累计载荷量96 %，能很好解释变量原始信息。由图1可知，鲜叶、D处理与青草气、嫩香属性均处于X轴的左边，青草气与D均处于第3象限内，距离较近，说明D与青草气相关性较大；而Z、G两处理与甜香、花香、豆香、板栗香、清香属性均在X轴的右边，其中G与花香属性相关性较高。PCA分析能较好的解释感官审评结果，即D具有明显青草气，G处理具有明显花香，Z处理各香气表现较为均衡。并且甜香、板栗香、豆香在载荷图上相距很近，说明这些香气属性存在较高相关性。

图1 主成分载荷图Fig.1 Biplot of principal component analysis (PCA)

2.3 不同杀青处理挥发性化合物GC-MS分析结果

HS-SPME-GCMS分析结果如表所示，样品总共检测出化合物67种，包括醇类23种，醛类15种、碳氢类13种，酮类6种，酯类10种。

鲜叶中共检测出51种化合物，含量最高的化合物的香叶醇((392.56±4.82) μg/kg),其次依次为苯乙醇((229.47±6.79) μg/kg)、水杨酸甲酯((209.95±12.87) μg/kg)、氧化芳樟醇Ⅰ((151.49±9.09) μg/kg)、芳樟醇((123.92±12.38) μg/kg)、(Z)-3-己烯-1-醇((115.5±3.15) μg/kg)、氧化芳樟醇Ⅱ((114.63±1.06) μg/kg)、苯甲醇((70.9±10.74) μg/kg)、香叶醛((45.61±7.80) μg/kg)、正己醛((33.02±2.96) μg/kg)、间二甲苯((28.55±7.98) μg/kg)。

D共检测出55种化合物，含量较高的依次为香叶醇((348.21±24.79) μg/kg)、苯乙醇((141.51±7.70) μg/kg)、氧化芳樟醇Ⅰ((97.19±7.85) μg/kg)、氧化芳樟醇Ⅱ((75.05±7.32) μg/kg)、芳樟醇((47.31±16.36) μg/kg)、水杨酸甲酯((39.64±9.54) μg/kg)、乙酸丁酯((25.93±6.71) μg/kg)、 (Z)-3-己烯-1-醇((20.54±0.88) μg/kg)、正戊醇((17.69±2.31) μg/kg)。

Z共检测出57种化合物，含量较高的依次为：香叶醇((242.36±21.15) μg/kg)、苯乙醇((114.1±26.94) μg/kg)、氧化芳樟醇Ⅰ((74.53±17.13) μg/kg)、氧化芳樟醇Ⅱ((61.79±14.94) μg/kg)、水杨酸甲酯((35.09±12.83) μg/kg)、芳樟醇((47.04±9.47) μg/kg)、苯甲醇((27.54±8.33) μg/kg)、乙酸丁酯((22.56±5.05) μg/kg)、(Z)-3-己烯-1-醇((20.09±2.21) μg/kg)、δ-杜松烯((12.41±2.82) μg/kg)

G共检测出52种化合物，含量较高的依次为：香叶醇((101.2±4.22) μg/kg)、苯乙醇((80.45±7.03) μg/kg)、氧化芳樟醇Ⅰ((46.18±3.86) μg/kg)、氧化芳樟醇Ⅱ((37.97±3.77) μg/kg)、芳樟醇((24.81±3.52) μg/kg)、正戊醇((19.96±3.51) μg/kg)、水杨酸甲酯((19.33±3.33) μg/kg)、乙酸丁酯((11.82±1.37) μg/kg)、(Z)-3-己烯-1-醇((11.22±1.04) μg/kg)、苯甲醇((11.22±0.75) μg/kg)、氧化芳樟醇Ⅳ((10.05±0.63) μg/kg)。

醇、醛、酯类化合物在不同杀青温度下均呈现明显降低。C6醇是茶叶中的青味主要来源[21],这类化合物大多沸点较低，在热加工时易挥发，随杀青温度升高，散失程度也随之增大本研究中，鲜叶中C6以(Z)-3-己烯-1-醇含量最高，D、Z、G三处理(Z)-3-己烯-1-醇含量较鲜叶(209.95 μg/kg)分别降低了82.21%、83.60%、90.28%。研究证明[22]，鲜叶中(Z)-3-己烯-1-醇含量较高故呈现“青臭”，而经过热加工后，(Z)-3-己烯-1-醇的散失使得茶叶清香等其他香气属性得以体现，这与本研究中定量描述分析结果中青臭气、清香的属性得分表现一致。

芳樟醇、氧化芳樟醇Ⅱ、氧化芳樟醇Ⅰ、苯乙醇、香叶醇在成品茶中含量较鲜叶均明显也降低，并且在D中含量最高，在Z中含量次之，在G中含量最低。这些化合物均已被证明是绿茶呈香的重要组分，芳樟醇是茶叶中的典型化合物，主要来源于糖苷水解[10]，ZHU等[23-24]研究证明，芳樟醇不仅是西湖龙井茶中的主要化合物，也是板栗香绿茶的关键化合物。本研究中D、Z、G 三处理芳樟醇变化趋势明显，其含量分别为47.31、47.04、24.81 μg/kg，较鲜叶(123.92 μg/kg)分别降低了61.82%、62.04%、79.98%。

检出的15种醛类化合物中，随着杀青温度升高，香叶醛、壬醛、苯甲醛含量降低幅度越大。而2-甲基丁醛、异戊醛、正辛醛均未在鲜叶中检出，其含量在D、Z、G三处理中呈降低趋势，据报道，这些化合物是来自脂肪酸的降解[2]。呈现焙烤香的美拉德反应产物乙基吡咯2-甲醛，以及具有木香、辛香的类胡萝卜素降解产物藏红花醛均仅在G中检出，这对于高香绿茶加工至关重要。检出的10中酯类化合物中水杨酸甲酯降低趋势最为明显。相较鲜叶(209.95 μg/kg)D、Z、G分别降低了81.12%、83.29%、90.79%。

RAVICHANDRAN等[25]报道脂肪酸降解产物含量的减少利于茶叶香气的形成。本研究中，低级脂肪醇、醛降解趋势随杀青温度升高，降低幅度越大。此外，对香气形成有利的美拉德反应产物、类胡萝卜素降解产物则呈现积累趋势。为进一步探究化合物组分含量差异对香气形成的影响，对其进行OAV值的计算。

2.4 不同杀青处理挥发性化合物OAV

OVA值是化合物含量与其阈值之比，通常认为OAV>1的化合物对香气有较大贡献。如表4，查阅文献计算出样品中OAV>1的化合物共23种[26-32]。其中芳樟醇为所有成品茶中OAV最高的化合物。而在鲜叶中含量较高的(Z)-3-己烯-1-醇，因其阈值较大所以其OAV值在D、Z、G中均小于1；相反，癸醛在各样品中含量相对较低，但其阈值较低，三处理中其OAV>1。在D处理中、带有青味属性的正己醛、庚醛均有较高的OAV值，说明青气属性在D处理中有较大优势。带有明显甜香的β-环柠檬醛仅在Z处理中其OAV>1。G处理整体香气强度小于Z、D两处理，不同杀青温度处理间挥发性化合物在组成比例和主要化合物相对含量变化上也有一定差异[22]。不同化合物在各处理中变化积累的不同则会导致各干茶样品香型差异。

表4 样品中检出挥发性化合物的含量及OAV值Table 4 The content of volatile compounds detected in the samples and their OAV value

续表4

序号RI中文名英文名含量/(μg·kg-1)OAVXDZGXDZG阈值/(μg·kg-1)香气属性361189丁酸叶醇酯3-hexenylbutyrate19.79±3.192.89±0.383.21±0.831.13±0.22----NF青香371192水杨酸甲酯 methyl salicylate 209.95±12.8739.64±9.5435.09±12.8319.33±3.335.25 0.99 0.88 0.48 40 冬青味381196α-萜品醇α-trepineol12.18±0.935.65±0.425.65±1.273.46±0.410.44 0.20 0.20 0.12 28甜香391198藏红花醛safranal---0.77±0.12----NFNF401198反-2-己酸丁酯(E)-2-hexenyl butyrate2.01±0.131.37±0.140.73±0.11-----NFNF411210癸醛decanal 2.10±0.771.26±0.181.40±0.271.65±0.1520.98 12.64 13.98 16.54 0.1香气青辛微甜421222β-环柠檬醛β-cyclocitral4.87±1.05-5.43±0.081.91±0.440.97 -1.09 0.38 5甜香431230橙花醇neraniol15.76±2.2259.56±0.515.87±0.81-0.20 0.12 0.07 -80柠檬香441236异环柠檬醛isocyclocitral2.98±0.473.58±0.180.95±0.18-----NFNF451239正戊酸-(Z)-3-己烯酯3-hexenyl pentanoate6.75±2.241.76±0.173.11±0.721.04±0.42----NFNF461245橙花醛cis-citral7.12±2.14-2.35±0.480.85±0.081.42 -0.47 0.17 5柠檬香471263香叶醇geraniol392.56±4.82348.21±24.79242.36±21.15101.2±4.229.81 8.71 6.06 2.53 40甜玫瑰花香481280香叶醛α-citral 45.61±7.8017.82±0.9211.92±1.166.33±0.481.14 0.45 0.30 0.16 40柠檬香491340香叶酸甲酯methyl-E-geranate1.95±0.57-0.80±0.06-----NFNF501361α-荜澄茄油烯α-cubebene-2.89±0.293.81±0.712.28±0.59----NFNF511388(Z)-己酸-3-己烯酯cis-3-hexenyl hexanoate-7.60±0.289.45±2.443.53±1.32----NF水果青香521392己酸己酯hexyl hexanoate-1.55±0.01------NF嫩荚青刀豆香531394顺式茉莉酮(Z)-jasmone17.46±3.396.72±0.326.2±1.513.74±0.62----NF茉莉花香541397十一醇undecanol1.48±0.390.61±0.13--0.02 0.01 --70甜脂蜡香551420β-石竹烯caryophyllene 1.88±0.71-1.61±0.08-0.19 -0.16 -10丁香似香561444大根香叶烯germacrene D---1.37±0.41----NFNF571452香叶基丙酮geranylacetone2.06±0.681.96±0.162.45±0.660.22±0.010.21 0.20 0.24 0.02 10花香581457丁香烯humulene1.21±0.580.74±0.080.86±0.120.70±0.14----NFNF591474β杜松烯β-cadinene0.60±0.151.03±0.141.22±0.201.08±0.44----NFNF601481环氧-β紫罗酮β.-Ionone epoxide---0.36±0.01----NF木香611511δ-杜松烯δ.-cadinene5.53±1.559.95±0.6112.41±2.827.91±2.32----NFNF621512菖蒲烯calamenene2.53±0.402.75±0.193.59±0.732.82±0.77----NFNF631535橙花叔醇nerolidol2.82±0.370.80±0.120.95±0.160.53±0.120.28 0.08 0.10 0.05 10玫瑰及苹果香641559柏木脑cedrol1.05±0.080.82±0.110.86±0.010.85±0.112.10 1.64 1.72 1.70 0.5膏香、木香651576毕橙茄醇cadinol2.77±0.352.11±0.222.74±0.341.83±0.19----NFNF661763植酮fitone-0.45±0.010.51±0.150.47±0.01----NFNF671786叶绿醇plantalcohol-0.45±0.040.54±0.03-----NFNF

注：“-”表示未检出；NF表示未查阅到相关信息

3 结论

由QDA分析和PCA分析可知，不同杀青温度制得样品香气属性上差异明显。具体体现在270 ℃杀青处理与青草气属性相关性较高；320 ℃杀青处理与甜香、板栗香、豆香等属性具有一定相关性，各香气表现较为均衡；370 ℃杀青处理与花香属性相关性最高，与豆香、板栗香等也存在一定相关性。

通过对270、320、370 ℃3个杀青处理样品种香气物质含量的检测可知，杀青使得鲜叶中含量较高的(Z)-3-己烯-1-醇、水杨酸甲酯等具有“青臭”属性的化合物含量下降，且随杀青温度的增加，其含量降低幅度越大；同时，豆香、花香、板栗香、等香型的关键化合物含量上升。

通过计算各化合物OAV值可知，(Z)-3-己烯-1-醇以及水杨酸甲酯的含量降低，加上其比较高的阈值，经杀青后这些化合物在茶叶香气呈现不再具有优势，转而代之的是香叶醇、芳樟醇等对茶叶香气形成有利的化合物。这与QDA及GC-MS结果一致，OAV值结果表明：270 ℃杀青处理中带有“青味”属性的化合物大多OAV>1，致使270 ℃杀青处理呈现明显青草气；具有甜香的β-环柠檬醛仅在320 ℃杀青处理中OAV>1，可能是320 ℃杀青处理呈现较270、370 ℃杀青呈现更明显甜香的原因；370 ℃杀青处理整体香气强度远低于270、320 ℃杀青，但370 ℃杀青处理中水杨酸甲酯等对茶叶香气形成不利的化合物含量最低，而其具有的嫩香、豆香、花香等香气属性具有贡献的化合物OAV占比相对较高，使其呈现更加丰富的香型。OAV分析结果能较大程度上与感官审评结果取得一致性，均说明较高的杀青温度对于有利于青草气的散失，以及豆香、花香、板栗香等香气的形成，有利于高香绿茶加工。