高粱和地球囊霉联合修复锶污染土壤研究

亓 琳,李艳玲,向 璐, 赵 威,王晓凌

1 河南科技大学农学院, 洛阳 471023 2 洛阳市共生微生物与绿色发展重点实验室, 洛阳 471023 3 中国科学院生态环境研究中心城市与区域生态国家重点实验室, 北京 100085

放射性核素锶(strontium,Sr)为典型的长寿命核素,半衰期为28.79年[1]。已发现锶有19个放射性同位素,其中长半衰期的锶- 90和锶- 89分别属于高毒性和中毒性核素[2]。锶- 90为铀在核试验中产生的裂变产物,存在于核爆炸的辐射微尘中,以粉尘的形式或者随着食物链的富集最终进入人体,作为β射线的放射源对人体产生放射危害。研究发现,锶与钙在人体内的代谢具有很高的相似性,锶为亲骨性元素,沉积于人体内富含钙的器官,骨骼和牙齿是锶的主要储存库[3]。锶在我国土壤中的背景浓度,呈现地区分布不均匀性。甘肃、青海、新疆和西藏地区的锶污染最为严重,土壤锶浓度最高可达到1120—2112 mg/kg[4]。青海地区平均锶浓度为334 mg/kg[5]。新疆是典型的内陆干旱地区,新疆污水库的使用使其周边的土壤盐渍化加剧,增加了一些稀有金属元素,如锶对土壤的污染,周边土壤的平均锶浓度达到333 mg/kg[4, 6]。大连地区表土中锶浓度最高达到763 mg/kg,平均锶浓度为236 mg/kg[4]。目前,我国面临的土壤污染趋势不容乐观,放射性核素导致大范围的土壤遭到污染,开展修复90Sr污染土壤的研究很有必要。研究表明放射性核素在环境中与其稳定性同位素在环境中的行为相似[7]。于是,观察稳定态锶- 88在土壤和植物中的行为,是一个预测其放射性同位素锶- 90行为的方法。

植物修复技术是指利用植物从环境中吸收富集重金属和放射性核素等物质,具有成本低且绿色环保的优点[8],该技术被用于缓解或去除土壤重金属、核素污染。长期的实践不断证明,通过该技术修复污染土壤是行之有效的[9]。修复的成效则关键取决于修复植物自身的生物学特性。放射性核素通过土壤在植物体内进行富集,对植物造成了双重伤害,其一是核素发出的辐射射线会对植物造成严重的辐射伤害,其二核素本身在植物体内具有累积效应,当累积达到一定程度后会对植物生长代谢造成严重影响。由于不同植物生物学特性不同,对核素的吸附效果以及响应机制也相差很大[10]。因此,植物修复技术的关键就是筛选出合适的植物[11]。长期以来,超累积植物是人们普遍关注的修复植物。研究表明超累积植物具有三大特征,包括富集重金属量高、具有解毒机制以及对不同重金属的富集有差异,生物富集系数(bioconcentration factor,BCF)和转运系数(translocation factor,TLF)大于1是判定超富集植物的重要标准[12]。先前研究所关注的超累积植物主要是芸苔属(Brassica)如印度芥菜(Brassicajuncea),庭芥属(Alyssum)如南庭芥(Aubrietacultorum)、遏蓝菜属(Thlaspi)如天蓝遏蓝菜(Thlaspicaerulescens)等,但它们存在很多不足之处,比如生物量较低且难以大规模种植,因而其在实际修复中的应用受到限制,较高的地上生物量可以弥补这些缺陷。最理想的超累积植物,理想的超累积植物往往是BCF>1,TLF>1,且生物量较大。因此,一些生长速率快、生物量大、可富集重金属的植物类型被应用于植物修复[13]。

能源作物在我国资源丰富,且是生物质能源的原料,将能源作物运用到植物修复技术前景广阔。高粱(Sorghumbicolor(L.) Moench),禾本科,一年生草本植物,其生物量大、根系发达、生长速度快等优点有利于对土壤中污染物的富集,是目前最具修复潜力的能源作物之一[14]。能源作物高粱的秸秆可用于生产乙醇,将高粱用于植物修复具有两个优势,其一治理了土壤重金属污染；其二可用于生产工业酒精。由此,高粱作为修复植物解决了富含重金属的植物难以处理的问题[15]。高粱具有庞大的根系对土壤中重金属有很强的吸收能力[16]。然而,高粱转运重金属至地上部分的能力与超富集植物相比较弱,难以快速修复重金属污染土壤,这一缺陷极大的限制了植物修复效率[17]。研究者们提出了许多强化植物修复效率的方法,如通过添加植物激素或接种微生物促进植物生长的等方法以增强重金属在植物中富集[18-19]。其中,利用微生物与植物形成微生物-超累积植物共生体来加强植物修复效率成为目前植物修复领域的重要研究方向[20]。丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi,AMF)用于植物修复的四大优点分别是：分布广；可与陆地上多数(80%)植物互利共生；可以提高共生植物的抗逆性；能够加强植物对重金属的吸收。AMF在植物抗病、抗盐碱、抗旱方面作用效果明显,在土壤修复中的作用也很突出[21]。AMF-超累积植物共生体可以提高植物对矿质营养的吸收效率,提高植物的抗逆性,增强植物对重金属的耐受力以及调节植物对重金属的吸收和转运,加强植物修复技术在土壤污染中的作用[22]。

通过对4种AMF,包括地球囊霉(Glomusgeosporum)、地表球囊霉(Glomusversiforme)、摩西球囊霉(Glomusmosseae)、透光球囊霉(Glomusdiaphanum)的比较研究,其中,地球囊霉对增强高粱对锶耐受能力的效果最好。本研究在高粱修复锶污染土壤体系中加入地球囊霉,在不同锶浓度污染中,通过地球囊霉对高粱富集和转运锶能力的影响以及对土壤酶活性和土壤养分状况的影响,评价接种地球囊霉对高粱根际土壤微生态环境的影响,评估地球囊霉在强化高粱修复核素锶污染土壤的应用价值,从而为地球囊霉-植物共生体修复锶污染土壤提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌种：丛枝菌根真菌选择地球囊霉。选择花生(Arachishypogaea)作为地球囊霉的宿主,在土壤中进行菌种繁育80d,清除植物地上部分和表层土,将孢子、菌丝和侵染的根段混合物作为接种剂。

供试植物：本试验采用的供试植物为高粱。用酒精(75%)浸泡种子5 min后,用H2O2(3%)灭菌10 min,之后用灭菌水冲冼3次。

供试土壤：在河南科技大学周山校区农场土采集试验土壤。土壤基本理化性质按常规方法测定[23]。土壤pH值为8.05,有机质含量为12.85 g/kg、全氮含量为0.96 g/kg、速效磷含量为12.52 mg/kg、速效钾含量为155 mg/kg、铵态氮含量为2.01 mg/kg,阳离子交换量为19.23 cmol/kg,锶含量为25.06 mg/kg。

1.2 试验设计

将实验用土充分混均,放入袋子中,采用湿热灭菌方法用高压灭菌锅在121℃下处理24 h[24],冷却后备用。在每个塑料盆(高=16 cm,底径=12 cm,口径=22 cm)中装入风干土8 kg。每盆中播入20粒种子,出苗后定苗为每盆10株。将试剂SrCl2·6H2O(分析纯)溶于超纯水中制成溶液,设置Sr2+浓度为0、75、725、975 mg/kg,充分混匀,平衡3周。采用双层接种法在每盆中均匀加入40 g接种剂至盆钵2/3处,以灭菌接种剂作为对照组(non-AMF)。

1.3 测定指标与方法

1.3.1菌根侵染率

在锶处理60 d后,取整株高粱,每盆6株。用直尺和游标卡尺测量幼苗的株高和根长。丛枝菌根染色方法参考Phillips和Hayman[25]。菌根侵染率(%)=(根段中被菌根侵染的长度/检测根段的长度)×100%。

1.3.2菌根依赖性

取不同锶浓度处理的整株高粱,每盆6株。杀青温度为105℃,持续杀青30 min,在烘箱中55℃持续烘干至恒重,用万分之一天平称重。菌根依赖性(%)=(接种从枝菌根真菌的植秼干重/未接种的植秼干重)×100%。

1.3.3株高、根长、生物量的测定

取不同锶浓度处理的整株高粱,每盆6株。分别用直尺和游标卡尺测量,对幼苗的株高、根长进行测量。杀青温度为105℃,持续杀青30 min,在烘箱中55℃持续烘干至恒重,用万分之一天平称重。

1.3.4锶富集浓度的测定和计算

植物样品烘干后,被分成根、茎、叶3个部分。分别取根、茎、叶2.0 g样品,250℃下灰化,持续增温至500℃,之后灰化2 h。将1 g灰化样品混入6 mL的HCl-HNO3-H2O2(体积比为1∶1∶1)。采用ICP-AES(电感耦合等离子体原子发射光谱法)测定植物样品中锶浓度[26]。

生物富集系数(bioconcentration factor,BCF)﹦植物地上部分锶浓度/(处理锶浓度+土壤本底值)。

转运系数(translocation factor,TLF)﹦地上部分锶富集浓度/根中锶富集浓度。通常,富集植物的TLF大于1,而非富集植物的TLF小于1[27]。

1.3.5土壤营养成分的测定

土壤有机质含量的测定方法为重铬酸钾外加热法,土壤全氮含量的测定方法为凯氏蒸馏法,土壤全磷含量的测定方法为浓硫酸高氯酸消解-钼锑抗比色法,土壤速效磷含量的测定方法为碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法,土壤速效钾含量的测定方法为乙酸铵浸提-原子吸收光谱法[23]。

1.3.6土壤酶的测定

转化酶测定方法为3, 5-二硝基水杨酸比色法,磷酸酶活性测定方法为对硝基苯磷酸二钠(PNPP)-比色法测定,蛋白酶活性测定方法为茚三酮比色法测定,脲酶活性测定方法为尿素-凯氏定氮法,脱氢酶活性测定方法为TTC法[28]。

1.4 数据处理

用SPSS软件(version 13.0；SPSS Institute Chicago,IL,USA)来进行统计分析,用最小显著性差异(LSD)判定处理之间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 锶胁迫下高粱的菌根侵染率

图1 锶胁迫下高粱的菌根侵染率 Fig.1 The mycorrhizal colonization rates of Sorghum bicolor under strontium stress不同小写字母表示不同处理之间差异显著 (P < 0.05)

所有锶处理组的菌根侵染率都大于50%。随着锶浓度的升高,菌根侵染率呈先上升后下降趋势(图1)。侵染率最高的为75 mg/kg(80%)和725 mg/kg(74.67%)处理,显著高于无锶添加处理(0 mg/kg)。在975 mg/kg处理中菌根侵染率有所下降,但与无锶添加处理的侵染率无显著性差异(P>0.05)。在无锶添加处理和975mg/kg处理中,菌根侵染率分别为54.67%和53.67%。

2.2 接种丛枝菌根真菌对锶胁迫下高粱生长的影响

高粱的整株生物量以及株高随着处理中锶浓度的增加,呈先增加后降低的趋势。在接种菌根组中,在低浓度75 mg/kg锶处理中,地上生物量最高。在接种菌根组中, 75 mg/kg和725 mg/kg锶处理中高粱的地上生物量显著高于无菌根组中的对应浓度(P<0.05),分别增加了33.23%和21.43%。在接种菌根组中,根生物量最高的为无锶添加处理和75 mg/kg处理,二者的根生物量均显著高于无菌根组,分别增加了43.98%和56.09%。接种菌根组中975 mg/kg处理与无菌根组的对应浓度相比,根生物量没有显著差异(P>0.05)。株高的最高值出现在75 mg/kg,而在725 mg/kg锶处理中下降,在无菌根组和接种菌根组之间差异不显著(P>0.05)。根长在无菌根组和接种菌根组之间相比没有显著性差异(P>0.05)(表1)。

以无菌根处理组中高梁的生物量为100%,高粱对菌根的依赖性随着锶浓度的增高呈先升高后降低(图2)。其中,在低浓度75 mg/kg锶处理,菌根依赖性最高为136.92%。在接种菌种组中,0—975 mg/kg处理时,菌根依赖性都高于100%。

表1 锶胁迫下接种地球囊霉对高粱生长的影响

同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；同列不同大写字母表示差异显著(P<0.05)

图2 锶胁迫下高粱的菌根依赖性 Fig.2 The mycorrhizal dependency of Sorghum bicolor under strontium stress

2.3 接种AMF对高粱锶富集能力的影响

与无菌根组相比,经过AMF处理后,高粱地上部分和根中的锶浓度显著增加(P<0.05)。高粱的地上部分和根部对金属锶的响应一致,地上部分和根部锶浓度都随着土壤锶浓度的增加而增加(表2)。

AMF接种处理中,高粱对锶的转运系数和富集系数都显著高于无菌根组(P< 0.05)(表3)。无菌根组中高粱对锶的转移系数和富集系数都小于1。AMF种处理中,转运系数在无锶添加处理和975 mg/kg锶处理中都小于1(但接近于1),而在75 mg/kg和725 mg/kg锶处理中都大于1。富集系数仅在无锶添加处理中小于1,而在锶添加处理中都大于1。AMF处理显著增强了高粱对金属锶的富集能力。

2.4 接种AMF高粱对锶污染土壤中营养成分的影响

接种AMF对土壤有机质、全氮、全钾和速效钾并没有显著影响,所有处理之间没有显著差异(P>0.05)(表4)。土壤全磷和速效磷含量与无菌根组相比显著减少,全磷减少了6.52%—18.77%；速效磷减少了12.38%—27.43%。

表2 接种地球囊霉对锶胁迫下高粱各部位锶富集浓度

表3 接种地球囊霉对高粱富集锶的转移系数和生物富集系数的影响

表4 接种地球囊霉对土壤营养成分的影响

2.5 接种AMF高粱对锶污染土壤中酶活性的影响

AMF对不同土壤酶活性的影响有差异(表5)。转化酶、蛋白酶、脲酶和脱氢酶在所有处理中没有差异(P> 0.05)。其中,接种AMF显著增加了土壤磷酸酶活性(P< 0.05),与无菌根组相比,增加了19.67%—32.56%。

表5 接种地球囊霉对土壤酶活性的影响

3 讨论

3.1 地球囊霉对高粱抗锶能力的影响

在所有锶浓度处理下地球囊霉对高梁的侵染率都超过了50%。在低浓度75 mg/kg和中间浓度725 mg/kg处理组时,地球囊霉的侵染率最高,显著高于其他无锶添加处理和高浓度975 mg/kg处理,这可能是由于地球囊霉在75 mg/kg和725 mg/kg锶处理下耐受能力较强。在所有锶处理中高梁都表现出显著的菌根依赖性(P<0.05),表明在锶处理中丛枝菌根有利于高粱生长。同时,接种地球囊霉显著增强了高粱耐受锶的能力。4个锶浓度梯度相比,在75 mg/kg和725 mg/kg锶处理时,高粱的菌根依赖性最强,与无锶添加处理相比,分别增加了38.52%和58.78%。接种地球囊霉显著增加了高粱的生物量(P< 0.05)。75 mg/kg和725 mg/kg锶处理组中高梁的地上生物量与对照相比分别增加了33.23%和21.43%,根生物量分别增加了43.98%和56.09%。高粱和地球囊霉互利共生,菌丝通过根的皮层细胞可以从植物体获得碳源,为菌丝生长提供了有利条件[29]。地球囊霉侵染高粱后形成庞大的菌丝体和植物根系网络,能够促进植物对矿质元素和营养成分的吸收,从而显著增加高粱的生物量。有研究表明AMF通过增强植物光合效率,能够促进宿主高粱生长并增强其抗逆能力[30]。在本研究中,地球囊霉有利于高粱生长,并提高了高粱对土壤锶污染的耐受能力。

3.2 地球囊霉对高粱富集转运锶能力的影响

菌根真菌能够影响土壤中重金属的生物有效性,比如AMF对重金属活化或钝化、吸收与固持的作用,从而影响植物对重金属的富集和分配。至今关于AMF对植物富集重金属能力的影响还没有一致的结论。接种地球囊霉能够增强万寿菊(TageteserectaL.)[31]和翅荚木(ZeniainsignisChun)[32]对重金属的富集能力。在本研究中,与无菌根处理组相比,接种地球囊霉处理显著增加了高粱地上部分和根的锶浓度(P< 0.05)。这一结果表明地球囊霉增加了金属锶在土壤中的生物有效性,促进了锶向植物体内的转移。地球囊霉接种处理显著提高了高粱对锶的转运和富集能力,TLFs和BCFs在接种AMF组显著高于无菌根组(P< 0.05)。这一结果与先前的研究一致,AMF通过调节重金属离子在植物体内的吸收和转运过程,促进了重金属从土壤向植物体的转移,从而增强植物修复的效果和效率[33]。此外,在重金属污染条件下,由AMF和植物形成的共生体可以改善植物对营养元素的吸收,有效地增强了植物对重金属污染的抗逆性,缓解了植物本身所受到的重金属毒害作用,使植物修复效率增加[34]。然而,由于AMF定殖于植物根系,进而强化了根系对重金属的吸收和固持作用,从而使重金属更多固定于土壤中。在高浓度Cd处理中,接种摩西球囊(Glomusmosseae)显著提高了Cd在玉米(ZeamaysL.)根中的富集,减少玉米地上部分的富集浓度,表明接种AMF能够增强玉米对Cd的固持作用[31]。接种地球囊霉显著增加了紫花苜蓿(Medicagosativa)根中Cd和Zn的富集浓度,而减少了地上部分的Cd和Zn富集浓度,表明地球囊霉增强了紫花苜蓿对Cd和Zn的固持作用,从而缓解重金属对植物的毒性作用[35]。然而,由于接种AMF能够促进宿主生长,当植物富集重金属总量相同时,植物富集的重金属浓度(单位生物量中重金属的富集含量)则会相应减少。因此,AMF对重金属的吸收和固持能力的增强效应,可能是AMF增加了植物的生物量而产生“稀释效应”[36]。

3.3 地球囊霉接种高粱对锶污染土壤中养分和土壤酶活性的影响

菌根真菌侵染植物根系后,影响植物根际的微生物群落结构和多样性,从而改变植物根际微生物的代谢活动。菌根真菌能够提高植物的营养水平,特别是磷素营养。一方面,AMF增强微生物解磷活性,增加土壤有机磷含量。另一方面,AMF可将难溶性元素转化为可吸收态,进而促进植物对元素的吸收。如通过促进植物分泌有机酸,将土壤中转化为磷酸盐,在磷酸酶的作用下,磷酸盐水解转化为易吸收态[33]。在本研究中,与无菌根处理组相比,接种地球囊霉处理中的全磷减少了6.52%—18.77%,速效磷减少了12.38%—27.43%。土壤中这部分减少的磷素可能由地球囊霉介导而输送至宿主植物体内。研究表明接种地球囊霉的黑麦草(LoliumperenneL.)地上部分和根系中的磷含量相比于未接菌黑麦草都有显著提高[37]。研究表明AMF会促进土壤酶的活性,包括酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、脲酶和蛋白酶的活性[35]。在本研究中,接种地球囊霉显著增加了土壤磷酸酶活性(P< 0.05),与对照相比,增加了19.67%—32.56%。AMF可能通过多种机制协同影响根际环境,提高土壤养分的可利用性,并缓解重金属对土壤酶的抑制作用,从而增强植物根际微生物的代谢活动。

4 结论

地球囊霉缓解了土壤锶污染对高粱生长的抑制作用,增强了土壤磷酸酶和转化酶活性,增强了高粱对锶的富集和转运能力。综上所述,地球囊霉可增强高粱对锶的富集和耐受能力,在锶污染(75—725 mg/kg)下接种地球囊霉的效果最好。丛枝菌根-高粱共生体具有良好的修复效果和应用前景。