基于亲脂性阳离子线粒体靶向化合物研究进展

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（1 十堰市人民医院 湖北医药学院附属人民医院药学部，湖北十堰 442000；2 湖北医药学院附属东风医院 血液风湿科，湖北十堰 442008）

线粒体是细胞生命活动的能量供应工厂，是多种生理生化过程的发生场所，同时，大多数脊椎动物中，细胞凋亡主要由线粒体调节。因此线粒体功能变化，直接影响一系列疾病（如：心脑血管疾病、糖尿病、神经系统疾病等）的产生和发展，尤其与肿瘤凋亡和转移、关系密切[1-2]。近年来，人们开始关注组织、细胞乃至细胞器相关的精确靶向治疗，小分子靶向抗肿瘤药物已成为抗肿瘤药物的研发主流，线粒体靶向策略引起了相关研究者高度重视。目前将药物靶向线粒体的策略和方法主要有三种：离域化的脂溶性阳离子向导(delocalized lipophilic cation, DLC)、线粒体靶向的肽链片段(mitochondrial targeting sequence, MTS)以及囊泡载体(vesicle)。本文将着重对离域化的亲脂性阳离子（DLC）介导的靶向小分子化合物研究进行综述。

1 亲脂性阳离子（DLC）线粒体跨膜导入机制

线粒体间隙带有大量正电荷，其基质中带有大量负电荷，从而形成线粒体内膜的跨膜电位(mitochondrial transmembrane potential, MTP)。MTP内负外正，在机体正常细胞中，其值为-130mV～150mV，当亲脂性阳离子在线粒体富集到线粒体膜内外电位平衡的时候，则会在线粒体内聚集[3]。肿瘤细胞的线粒体膜电位往往高于正常细胞[4]，因此，将亲脂性阳离子与小分子通过共价键直接连接，可仅仅依赖于静电吸附，不通过复杂的机制穿透线粒体膜，随后，释放出的生物活性分子直接在线粒体中发挥作用，诱导肿瘤细胞死亡或凋亡。

亲脂性阳离子载体主要包括三苯基膦（TPP）、其衍生物如十八烷基三苯基膦（STPP）、三乙胺盐、地喹氯胺（Dequalinium chloride，DQA）、消旋－四苯卟吩等[5]。TPP是其中最典型的、应用最广泛的，TPP末端活泼基团能与药物连接且保持药物活性，结构整体由亲水性带电基团和疏水性基团构成，三个苯环π电子云的离域现象使整个分子带正电荷[6]，由此可在线粒体膜电位的驱动下，携带小分子药物靶向线粒体内部。DQA是一种季铵盐[7]，结构中有两个对称的正电荷中心，由长脂肪链连接，能够穿透脂质双分子层，能满足化合物不同位点的多种结合方式。结构如图1所示。

图1 亲脂性阳离子TPP和DQA的化学结构Figure 1 The structure of compounds TPP and DQA

近年来研究证实，TPP与DQA作为应用广泛的DLC，用于修饰活性小分子化合物成功地实现线粒体靶向，在一定程度上应用于抗肿瘤药物靶向于线粒体抑制细胞增殖、抗氧化药物靶向治疗线粒体氧化损伤以及设计出一系列靶向线粒体的荧光探针等，以期达到最佳的治疗效果及较低的给药剂量。当然，若DLC在线粒体中大量聚集，其正电荷可能会导致膜电位的丧失以及影响呼吸链电子传递[7]，在使用此项策略时也应关注细胞毒性。

2 以TPP为载体的线粒体靶向化合物

首次使用TPP的线粒体靶向偶联物的研究报道于1995年，Burns J.等[8]设计合成了14C标记的硫醇探针，由三苯基溴化磷（TPP）将其靶向导入线粒体，用来标记蛋白硫醇，从而对线粒体氧化应激过程进行探索。1999年，新西兰达尼丁Otago大学Smith课题组率先合成靶向线粒体的抗氧剂MitoVite E[9]，并证明了将抗氧剂靶向转移进入线粒体，可有效阻止线粒体氧化损伤。随即，辅酶Q10和TPP 的缀合物MitoQ10[10]、SOD辅基模拟物与TPP的缀合物MitoSOD等[11]相继被研发并证明了其可对组织的氧化应激损伤进行选择性保护。2017年，张宇睿选天然抗氧化剂迷迭香酸为先导化合物，经TPP修饰得到线粒体靶向迷迭香酸Mito-RA[12]；对NADPH活性基团结构进行剖析，设计合成线粒体靶向二氢吡啶类化合物Mito-N[13]。研究发现迷迭香酸经TPP修饰后，对ROS清除效果和辐射防护效果都得到提高；Mito-N类化合物能通过清除辐照产生的ROS而有效保护CHO-K1或Hela细胞的遗传物质完整性。化合物结构如图2所示。

图2 以TPP为载体的靶向抗氧剂Figure 2 The structure of targeted antioxidants with TPP

线粒体靶向的抗肿瘤药物分子设计，最直接的方法是通过酰胺键、醚键、碳磷键等将TPP与活性小分子连接。2002年，Fantin等[14]将TPP通过吡啶鎓离子与F16分子合成具有线粒体靶向性和内在荧光的化合物F16-TPP，在线粒体大量聚集，且显示出了对多种肿瘤细胞的杀伤能力。选择现有的抗肿瘤药物进行结构改造，也是靶向药物设计的重要思路，浙江大学韩旻教授课题组将多柔比星与 TPP 化学连接, 显示了良好的线粒体靶向作用, 并且通过线粒体途径诱导了肿瘤细胞的凋亡, 克服肿瘤细胞耐药性[15]。2018年Lee J H等[16]基于三苯基膦-香豆素探针（TPP-C）的线粒体靶向药物制剂，制备了由TPP和多柔比星（DOX）修饰的制剂（TPP-C-DOX）。通过线粒体靶向配体TPP介导的线粒体跨膜过程，TPP-C-DOX 被内化于线粒体中。随后，DOX从线粒体中的TPP-C- DOX 释放，作用于线粒体DNA（mtDNA），导致肿瘤细胞线粒体功能障碍，最终死亡。青蒿素作为抗疟药，近年来对其抗肿瘤作用的研究引起了相关领域的关注，2016年，新加坡国立大学Zhang Chongjing课题组先合成ART-TPP[17]，将ART引导到线粒体中，从而提高ART的活化水平并靶向更多的蛋白质靶标。进一步合成ART-TPP-Alk，通过点击化学方法连接荧光分子和生物素标签，由于线粒体是细胞的强大动力，更多线粒体蛋白被ART-TPP-Alk共价修饰。2017年，Noh等[18]报道了一种线粒体靶向光动力治疗药物（MitDt），其结构主体为卤素原子与吲哚环结合的卤化物，能良好的被肿瘤细胞摄取并进入线粒体，吸收光能从而将氧转化为自由基形态导致细胞程序性死亡。以上化合物结构如图3所示。

图3 以TPP为载体的靶向抗肿瘤剂Figure 3 The structure of targeted antitumor agents with TPP

综上所述，TPP修饰的小分子化合物能成功实现线粒体靶向，其应用广泛，对抗氧剂、抗肿瘤剂的结构改造提供了可靠的思路。并且运用靶向线粒体技术，人们设计并合成了许多特异性的荧光探针，可用于探索研究药物作用靶点或检测线粒体内相关指标。此外, 纳米载体 (脂质体、树枝状大分子等) 与 TPP化学键合, 可将包载的小分子药物靶向到线粒体，逐渐成为了研究的热点问题。

3 以DQA为载体的线粒体靶向化合物

地喹氯胺（DQA）亦可直接与小分子连接，发挥线粒体靶向作用。2015年，宋彦峰等[19]将阿霉素与地喹氯胺连接合成DQA-DOX， 细胞毒性实验显示：与游离DOX相比，DQA-DOX对A549细胞的毒性明显比游离DOX低，但DQA-DOX对耐DOX细胞MCF-7/ADR细胞的毒性比游离DOX显著增强。结构如图4所示。

图4 化合物DQA-DOX的分子结构Figure 4 The structure of the compound DQA-DOX

但更多的研究表明，DQA形成的囊泡状聚集体DQAsomes，其具备较高的稳定性，不易沉淀，彼此融合，可聚集在溶液中，仍可穿透磷脂双分子层进入线粒体，成为可包裹小分子的靶向载体[19-20]。2005年，Chen SM等[21]制备了基于DQA somes修饰的紫杉醇脂质体，将裸鼠接种人结肠癌COLO- 205细胞以产生肿瘤，再将药物作用于各组小鼠，结果显示紫杉醇组对肿瘤无明显抑制，而DQAsomes紫杉醇脂质体组对肿瘤抑制率达50%。Zhang等[22]将抗性调节剂奎纳克林与柔红霉素同时掺入线粒体靶向的DQA脂质体中，研究结果显示：体外抑制MCF-7干细胞和治疗小鼠复发肿瘤方面疗效明显增强，可用于治疗和预防由MCF-7癌症干细胞引起的乳腺癌复发。DQA somes对于药物的包裹作用，有利于保持药物原有性状，同时也可满足多数无法较好被吸收的药物，能根据具体需要改变脂质体系统理化性质。Li N等[23]在对白藜芦醇的研究中，合成了DQA-PEG2000-DSPE脂质体用以包裹白藜芦醇，将其递送至线粒体，检测其对非小细胞肺癌A549细胞或非小细胞肺癌A549耐药细胞抑制能力，结果显示白藜芦醇脂质体在耐药性和非耐药性肿瘤细胞中均能诱导细胞凋亡，并随之释放细胞色素C，诱导细胞凋亡。

多数研究表明，DQA somes不仅可特异性将药物分子运送到线粒体中，而且能够保护分子免于酶的降解，增加细胞对药物的摄取。例如在与DNA组装成的脂质体的研究中，DQA somes与模拟胞浆膜的脂质作用时，不能释放DNA，但与模拟线粒体膜且富含心磷脂的脂质作用时，则可以释放出DNA[24]。这种策略能更好的使药物特异性作用于靶点，而降低治疗过程中的毒副作用。

4 其他DLC介导的线粒体靶向化合物

近年来对于肿瘤的治疗中，光动力疗法（PDT）成为一种颇具前景的治疗手段，而选择合适的光敏剂是推进PDT广泛应用的重要因素。目前有许多关于含有阳离子部分的光敏剂的报道，如铵和吡啶鎓，并且发现一些光敏剂具有线粒体靶向能力。2017年Taba等[25]设计了新型的原卟啉IX衍生物PPIX-1和PPIX-2，分别束缚了4个和8个胺部分，实现线粒体靶向聚集，发现这些分子在660nm激光照射后表现出优异的单线态氧量子产率，并且具有非常好的水溶性，较外源性PPIX有更强的体外PDT功效。结构如图5所示。

图5 化合物PPIX-1和PPIX-2的分子结构Figure 5 The structure of the compounds PPIX-1 and PPIX-2

四苯基卟啉衍生物也是广泛用于PDT的系列化合物，Hammerer等在对此系列化合物进行研究中发现，它们表现出高单线态氧量子产率以及高双光子吸收区，但细胞内化非常差。其课题组于2018年报道了卟啉-三苯胺杂化系列的新光敏剂，其引入基团乙烯基吡啶鎓三苯胺（TP）带有阳离子电荷，合成新的衍生物PTEG(TP)2，使水溶性大大增强的同时，具有线粒体靶向性[26]。新系列化合物的理化性质改进与其特定的线粒体定位能力相结合，显著提高了双光子激活光动力的治疗效率。

2018年，Mingxing Hu等[27]提出了一种新的可溶性线粒体靶向性烷化剂HMX-1，在细胞水平上具有优异的线粒体靶向能力，其在低氧条件下偶氮键被选择性地还原，苯胺氮芥（核DNA烷化剂）被释放，同时伴随荧光显著增加，证明前药的活化。在四种人癌细胞系（恶性黑素瘤A375，乳腺癌MDA-MB-231，肺癌A549和前列腺癌DU145）和正常人结肠中进行MTT测定，以评估HMX-1的抗癌活性，常氧条件下HMX-1的细胞毒性高于缺氧条件，且在常氧和缺氧条件下对NCM-460分别比A375细胞的IC50值高出344%和228%。HMX-1体内活化机制如图6所示。

图6 化合物HMX-1的体内活化机制Figure 6 The in vivo activation mechanism of compound HMX-1

5 结语

线粒体靶向制剂提高肿瘤治疗精准性，降低对正常细胞的毒副作用，在目前的研究中，取得了许多积极的成果。本课题组亦将选择黄芩苷和茶多酚等作为先导化合物，选择性在结构中羟基结合位点接入TPP基团，使其具有线粒体靶向性。对目标化合物进行体外的抗氧化活性验证检测，再与肿瘤细胞共孵育，对细胞内活性氧水平进行检测以及研究肿瘤细胞的增殖、迁移和凋亡状态。除此以外，利用亲脂性阳离子线粒体靶向性，设计荧光探针，对线粒体活动相关指标或药物作用靶点探寻也是目前研究中可应用的重点方法之一。

亲脂性阳离子在小分子线粒体靶向化合物设计合成的领域中，展示出了其独特的优势和潜力，不仅能穿透线粒体膜，精确将药物分子带入线粒体基质中，且与药物分子结合可改变药物理化性质等。但其仍存在一些需要探讨和解决的问题：（1）TPP与药物活性基团结合；以缀合物形式存在细胞中，可能影响药物的疗效；（2）高浓度阳离子会使线粒体膜电位去极化而危及细胞生存；（3）尽管TPP具有良好的线粒体靶向活性，但其正电荷可能限制其使用，因为许多带负电荷的血液成分可能导致与TPP的治疗系统形成非特异性聚集体而失去作用。因此，基于现有基础研究，针对不同疾病生理生化状态，利用化学生物学技术进行针对性研究，优化线粒体靶向制剂。