PLA2R、THSD7A与IgG亚型在特发性膜性肾病中的诊断价值

薛痕 龚仲琴 常晓东 赵敏 杨有芹 马霞

625000 雅安，四川省雅安市人民医院肾内科

特发性膜性肾病(idiopathic membranous nephropathy，IMN)是成人原发性肾病综合征常见的病理类型，在我国发病率呈逐年上升趋势，一项大型多中心回顾性研究调查了2004～2014年我国71 151例肾穿刺病例，发现IMN所占比率为23.4%[1]。2009年Beck等[2]首次发现约70%的IMN患者肾小球中表达M型磷脂酶A2受体(phospholipase A2 receptor，PLA2R)抗原。现有的研究提示抗PLA2R抗体是诊断IMN敏感性及特异性较好的血清学标志物。此外，研究发现在8%～14%的PLA2R抗体阴性的IMN患者可以检测到另一种足细胞膜抗原——1型血小板反应蛋白7A域(thrombospondin type I domain containing 7A，THSD7A)[3]。但目前国内关于IMN患者肾小球PLA2R、THSD7A、免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)亚型及补体分布情况的研究报道不多。联合检测血清PLA2R抗原及其抗体，以及联合检测肾小球PLA2R、THSD7A与IgG4在IMN中的临床价值也有待深入研究。本研究通过检测IMN患者血清抗PLA2R抗体水平以及肾小球PLA2R、THSD7A和IgG亚型的表达，评价它们对于IMN鉴别诊断的价值。

资料与方法

一、研究对象

选取2016年1月至2019年6月在雅安市人民医院肾内科经肾脏病理活检确诊为肾小球病变并且资料完整的144例患者作为研究对象，按所患疾病分为IMN组72例和非IMN组72例。其中IMN组包括男性48例，女性24例，年龄(55.5±12.0)岁，Ⅰ期IMN 12例，Ⅰ～Ⅱ期IMN 4例，Ⅱ期IMN 52例，Ⅲ期IMN 4例；非IMN组包括男40例，女32例，年龄(45.2±13.0)岁，包括微小病变性肾病8例、IgA肾病32例、轻度系膜增生性肾小球肾炎6例、狼疮肾炎8例(Ⅳ+Ⅴ狼疮肾炎3例)、局灶节段性肾小球硬化10例、紫癜性肾炎8例。IMN的诊断是依据肾穿刺病理活检结果，并排除乙肝病毒感染、系统性红斑狼疮、肿瘤、药物或毒物等继发因素所致的继发性膜性肾病(secondary membranous nephropathy，SMN)。本研究选取的所有病例肾穿刺前均未经激素、免疫抑制剂治疗。本研究符合医学伦理学要求，并经我院伦理委员会批准。所有入选患者均签署知情同意书。

二、研究方法

1.临床资料收集 收集入选患者的性别、年龄、24 h尿蛋白定量(24 h urine protein quantity，24hUPro)、血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)、白蛋白(Alb)等相关临床资料。

2.血清PLA2R抗体检测 采用德国欧蒙公司抗PLA2R抗体IgG检测试剂盒检测患者血清PLA2R抗体滴度(ELISA法)，测定值≥20 RU/mL为阳性。检测由成都华银医学检验所有限公司完成。

3.肾组织病理观察 采用实时B超引导下行经皮肾脏穿刺术采集肾组织样本，染色后在光镜、荧光显微镜、电镜下观察。

4.肾组织PLA2R、THSD7A、免疫球蛋白及补体检测 使用Sigma公司鼠抗人PLA2R1、THSD7A抗体检测肾组织PLA2R及THSD7A(间接免疫荧光法)，使用Sigma公司鼠抗人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4抗体检测肾小球IgG亚型(直接免疫荧光法)。肾组织PLA2R、THSD7A、免疫球蛋白及补体的免疫荧光染色强度评估采用0～+++(0为阴性，+为弱阳性，++为中阳性，+++为强阳性)进行半定量评分。检测由沈阳迪安病理诊断中心完成。

三、统计学处理

结 果

一、血清抗PLA2R抗体与IMN的关系

1.两组患者临床资料比较 IMN组血清抗PLA2R抗体滴度、抗PLA2R抗体阳性率以及年龄明显高于非IMN组(P<0.01)，非IMN组Scr高于IMN组(P<0.05)，两组性别、血清Alb、BUN、24hUPro比较差异无统计学意义(P>0.05)。(表1)

表1 IMN组与非IMN组临床资料的比较

2.IMN组患者血清抗PLA2R抗体阳性者与阴性者临床资料比较 血清抗PLA2R抗体阳性者24hUPro明显高于阴性者(P<0.01)，血清Alb低于阴性者(P<0.05)。而两者年龄、性别、血清BUN、Scr比较差异无统计学意义(P>0.05)。(表2)

表2 IMN组PLA2R抗体阳性者与阴性者临床资料的比较

3.血清抗PLA2R抗体诊断IMN的价值 以肾活检病理为金标准，绘制血清PLA2R抗体诊断IMN的ROC曲线。结果显示，抗PLA2R抗体诊断IMN的灵敏度为61.11%，特异度为97.22%，阳性似然比为21.98，阴性似然比为0.40，Youden指数为0.58，AUCRoc为0.845(95%CI0.750～0.940)。(图1)

图1 血清抗PLA2R抗体诊断IMN的ROC曲线

二、肾小球PLA2R、THSD7A、IgG与IMN的关系

1.两组患者肾小球PLA2R、THSD7A、免疫球蛋白及补体表达比较 IMN组患者肾小球PLA2R阳性率为80.56%，平均荧光强度1.33±0.79；肾组织THSD7A阳性率为8.33%，平均荧光强度0.14±0.49。在IgG亚型中，IMN组患者以IgG4和IgG1沉积为主，IgG4阳性率为97.22%，IgG1阳性率为86.11%，两者相比差异无统计学意义(χ2=1.424，P=0.233)，但是IgG4免疫荧光强度明显高于IgG1(t=4.202，P<0.01)。所有IMN患者肾组织免疫荧光可见C3沉积，均未见补体裂解产物C1沉积。IMN组与非IMN组肾小球免疫荧光检测比较结果见表3、4。IMN肾小球IgG1、IgG4、PLA2R及THSD7A免疫荧光阳性图见图2。

图2 IMN肾小球IgG1、IgG4、PLA2R、THSD7A免疫荧光阳性图(IF，×200) A.IgG1；B.IgG4；C.PLA2R；D.THSD7A

表3 IMN组与非IMN组肾小球PLA2R、THSD7A、免疫球蛋白及补体免疫荧光强度比较

注：-表示未检出

表4 IMN组与非IMN组肾小球免疫荧光表达阳性率比较[例(%)]

2.肾组织PLA2R、THSD7A及IgG4对IMN诊断的价值 肾组织PLA2R、THSD7A、IgG4诊断IMN的灵敏性分别为80.56%、8.33%、97.22%，特异性分别为100.00%、100.00%、97.22%，AUCRoc分别为0.903(95%CI0.823～0.982)、0.542(95%CI0.408～0.675)和0.972(95%CI0.944～1.000)。(表5)

表5 肾组织PLA2R、THSD7A及IgG4诊断试验评价指标结果

3.肾小球PLA2R、THSD7A、IgG4联合检测的价值 肾组织PLA2R、THSD7A和IgG4中任一指标阳性即诊断IMN的敏感性为97.22%。肾组织PLA2R、THSD7A中任一指标阳性即诊断IMN的敏感性为86.11%。(表6)

表6 IMN组肾组织IgG4、 PLA2R和THSD7A联合检测结果(n=72)

注：+代表阳性，-代表阴性

4.PLA2R抗原及其抗体联合检测的价值 血清抗PLA2R抗体和肾组织PLA2R抗原任一指标阳性即诊断IMN的敏感性为83.33%。(表7)

表7 IMN组患者PLA2R抗原与抗体联合检测结果[例(%)]

讨 论

本研究结果显示血清抗PLA2R抗体诊断IMN的灵敏度为61.11%，特异度为97.22%，诊断IMN的ROC曲线下面积为0.845。其他研究结果与本研究相符合，目前国外众多学者报道抗PLA2R抗体诊断IMN的敏感性为52.1%～70.6%[4-7]，特异性为97%～100%[8-9]。血清抗PLA2R抗体检测方便易行，对于临床中有肾穿禁忌患者的IMN鉴别诊断具有重要价值。

除PLA2R抗体外，肾组织PLA2R抗原对IMN诊断也具有重要价值。Li等[9]的一篇共纳入了16项研究的Meta分析显示，肾组织PLA2R抗原对IMN诊断的敏感性、特异性分别为79%(76%～81%)、90%(88%～92%)。本研究显示肾小球PLA2R诊断IMN的敏感性为80.56%，肾小球PLA2R诊断的敏感性较血清抗PLA2R抗体高，而联合肾小球PLA2R抗原和血清抗PLA2R抗体检测，则诊断的敏感性提高为83.33%，提示联合PLA2R抗原抗体检测是诊断IMN更加敏感和可靠的方法。此外，本研究发现22.22%的患者肾组织PLA2R抗原阳性而血清PLA2R抗体阴性，提示血清PLA2R抗体阴性患者不能排除PLA2R相关IMN。这种情况存在的原因可能为：(1)在IMN发病的早期，血清循环PLA2R抗体与肾小球PLA2R抗原结合尚未饱和，血清中抗体滴度很低甚至测不出；(2)血清抗PLA2R抗体阳性率与IMN疾病活动度相关，当疾病缓解时血清循环抗PLA2R抗体被机体免疫系统清除而检测不出，与血清抗PLA2R抗体相较而言，肾小球足细胞PLA2R抗原清除相对滞后；(3)检验误差。

IgG亚型在IMN诊断中的作用也一直受到关注。本研究结果显示IMN患者IgG1与IgG4阳性率均较高，两者相比差异无统计学意义，但是IgG4免疫荧光强度明显高于IgG1，差异有统计学意义。Hofstra等[10]用间接免疫荧光法测定IMN患者IgG亚型，发现IgG亚型在肾小球的分布比例分别为IgG1(56%)、IgG2(4%)、IgG3(53%)和IgG4(69%)，并且IgG4的免疫荧光强度而非IgG1与IMN患者自发缓解相关。Schroeder[11]的研究发现IgG1在所有IgG亚型中比例最高(67%)，而IgG4在所有IgG亚型中少见(4%)。IgG1在免疫应答中普遍存在，故对IMN的诊断无特殊意义。管音等[12]的研究也指出IMN肾小球以IgG4沉积为主，IgG4强度高于IgG1和IgG3。IgG4阳性且C1q阴性，可以帮助鉴别IMN与膜性狼疮肾炎。Huang等[13]在一项纳入157例膜性肾病的研究中发现在膜性肾病早期(Ⅰ期)肾小球毛细血管沉积物以IgG1为主，在膜性肾病的中晚期(Ⅰ-Ⅱ期、Ⅱ期、Ⅱ-Ⅲ期、Ⅲ-Ⅳ期)则以IgG4沉积为主。本研究纳入的研究对象主要为Ⅱ期IMN患者，故肾小球IgG4阳性率和荧光强度均高。本研究显示IgG4对于IMN诊断的敏感性为97.22%，特异性为97.22%，提示IgG4对IMN鉴别诊断有很高的价值。此外，本研究发现IMN患者肾组织无补体裂解产物C1q沉积，分析其原因可能与IgG4对靶抗原的亲和力低有关，其独特的Fab臂交换反应(半抗体交换反应)决定了它不能结合补体Clq从而激活经典途径[14]。Larsen等[15]的研究也发现IMN患者肾小球Clq沉积少见或者检测不到，提示经典途径可能不是IMN补体激活的主要途径。IMN发病机制与补体密切相关，但补体反应是通过何种途径激活还有待探索。

2014年Tomas[3]团队发现一类新的足细胞抗原，即THSD7A，提出THSD7A可能是除PLA2R之外参与IMN发病的第二靶抗原。目前国内外学者研究发现肾小球THSD7A的阳性率约2%～9.1%(免疫组化法)[16-19]。本研究显示IMN患者肾小球THSD7A的阳性率为8.33%(包括2例肾小球PLA2R与THSD7A双阳性)，提示THSD7A阴性不能排除IMN的诊断。既往认为THSD7A与PLA2R相对独立，THSD7A仅存在于血清抗PLA2R抗体阴性的IMN患者。但近年来的报道打破了这一观念，发现2例IMN患者血清PLA2R和THSD7A抗体双阳性并且肾组织抗原双阳性[17]。Wang等[19]的报道显示THSD7A和PLA2R双阳性IMN患者，两种抗原共同定位于沉积的免疫复合物中，相互间无交叉反应，两者共同参与了免疫复合物的形成。目前尚不能确定这类患者是否与THSD7A相关IMN或PLA2R相关IMN类似，或者是一类完全不同的新类型。非常有意义的是本研究中也发现2例IMN患者肾小球PLA2R与THSD7A双阳性，证实了IMN中PLA2R与THSD7A两种靶抗原可以同时存在，但这类患者的临床特征及发病机制尚有待进一步研究。有研究提示THSD7A可能与肿瘤相关[19]，但本研究中2例患者已随访1.5年尚未发现肿瘤。此外，本研究发现8例IMN患者肾小球IgG4阳性而THSD7A及PLA2R均为阴性，这种现象的解释是除THSD7A及PLA2R外，IMN患者还存在其他致病性抗原，有研究报道IgG4同样为其他致病抗原如超氧化物歧化酶、醛糖还原酶、α-烯醇酶产生的特异性自身抗体[20-21]。

综上所述，血清抗PLA2R抗体、肾小球PLA2R、THSD7A及IgG4亚型对于IMN鉴别诊断具有较高的临床价值；肾小球PLA2R抗原和血清抗PLA2R抗体的联合检测，肾小球PLA2R、THSD7A与IgG4的联合检测可以增加IMN诊断的敏感性。但本研究尚存在不足之处：(1)本研究为单中心研究、样本量偏小；(2)因为SMN患者样本量少，本研究未单独设立SMN组和探讨SMN患者血清PLA2R抗体阳性率，以及肾组织PLA2R、THSD7A和IgG亚型的表达。有待后续开展更大样本量的研究，进一步验证本研究结论。