线纹香茶菜及其变种种质资源芽期抗旱性鉴定与评价

刘 洋，孟爽爽3，邱佳佳3，刘军民3，詹若挺

(1.广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心，广东 广州 510006；2.岭南中药资源教育部重点实验室(广州中医药大学)，广东 广州 510006；3.广州中医药大学中药学院，广东 广州 510006)

线纹香茶菜(Rabdosialophanthoides(R.lophanthoides))及其变种纤花线纹香茶菜(Rabdosialophanthoides(Buch.-Ham.Ex D.Don)var.Graciliflora(Benth.)Hara)、狭基线纹香茶菜(Rabdosialophanthoides(Buch.-Ham.Ex D.Don)var.Gerardianus(Benth.)Hara)为唇形科(Labiatae)香茶菜属(Rabdosia)植物[1]，其干燥地上部分具有清热利湿、凉血散瘀之功效，常在岭南地区民间作药用或茶饮，《广东省中药材标准》[2]和《云南省中药材标准》[3]等收录其为中药“溪黄草”的基源植物，是消炎利胆片、胆石通胶囊等多种中成药的组方原料。近年来，随着市场需求量的日益增大，岭南地区种植较为广泛。线纹香茶菜及其变种野生状态下常分布于溪边、沟边等水分充足的地方，其生长发育过程对水分的要求较高，一定程度上制约了其药材生产的规模化发展。因此，亟需筛选挖掘抗旱性良好的种质类型用于药材生产。目前，对线纹香茶菜及其变种的研究主要集中在化学成分和药理药效方面[4-7]，关于其干旱抗性方面的研究尚未见相关报道。因此，本试验开展线纹香茶菜及其变种的芽期抗旱性研究，为其抗旱性育种研究提供科学依据。

高渗溶液模拟干旱胁迫法在芽期抗旱性鉴定中应用较多，其中PEG-6000高渗溶液因其操作简单、可重复性好而被广泛应用[8]。本研究拟通过PEG-6000高渗溶液模拟干旱胁迫，测定15份线纹香茶菜及其变种种质10项与抗旱性相关的萌发指标，采用抗旱系数、主成分分析、抗旱性度量值(D值)与聚类分析相结合的方法，以综合评价其抗旱性，从而为线纹香茶菜及其变种抗旱种质鉴定筛选和抗旱育种提供方法和基础材料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

分别于广东、江西等地收集15份不同居群种质，种植于广州中医药大学时珍山线纹香茶菜种质资源圃，于果实成熟期采收种子，自然干燥后将种子置于4 ℃冰箱中密封保存。原植物经广州中医药大学刘军民教授鉴定为唇形科香茶菜属植物线纹香茶菜、变种纤花线纹香茶菜及变种狭基线纹香茶菜。详细信息见表1。

表1 15份线纹香茶菜及其变种种质信息

注：XW-02 、XH-01、XH-02、XH-06、XH-08为野生种质，其余均为栽培种质。

1.2 试验方法

1.2.1种子的预处理

将精选后的种子先用75%乙醇消毒30 s，再用0.1%高锰酸钾溶液消毒10 min，最后用蒸馏水冲洗5次，备用。

1.2.2芽期模拟干旱胁迫最适浓度

以XW-01、XJ-02、XH-02、XH-05等4份种质为材料，使用直径10 cm的培养皿内铺2张滤纸作萌发床，加入5 mL不同浓度的PEG-6000溶液，将50粒种子均匀置于滤纸上，蒸馏水萌发作对照。PEG-6000溶液设置5%、10%、15%、20%、25%不同浓度处理，置于光周期为14 h/10 h(昼/夜)，光照度为5 000 lx，温度为25 ℃，湿度为60%的人工气候箱中培养，每个处理3次重复，连续培养10 d，每天称重补充消耗的蒸馏水以保持溶液浓度不变。

1.2.3芽期抗旱性鉴定及抗旱指标筛选

依照上述培养方法，以15份种质为材料，以最适 PEG-6000溶液模拟干旱胁迫，以蒸馏水进行相同处理作为对照，3次重复。

1.3 测定指标

萌发第4天测定发芽势(GP)，萌发第10天测定发芽率(GR)以胚根露出种皮长度等于种子长度为发芽标准，第2天开始，每天统计发芽数，培养10 d后测量胚根长(RL)、下胚轴长(HL)、总芽长(TL)以及鲜重(FB)，70 ℃烘箱烘至恒重，称量干重(DB)，并计算胚根/下胚轴指数(RL/HL)、发芽指数(GI)、活力指数(AI)。

胚根/下胚轴指数(RL/HL)=胚根长的抗旱系数/下胚轴长的抗旱系数

发芽指数=∑(Gt/Dt)(Dt为发芽日数；Gt为相对应的每日发芽数)

活力指数=FB×GI(FB为幼芽鲜重；GI为发芽指数)

1.4 数据处理与统计分析

差异显著性分析方法采用dunnett检验[9]，进行5个不同浓度梯度PEG-6000溶液处理组与1个对照组的比较。

各指标的抗旱系数[10]和隶属函数值[11]分别按式(1)和式(2)进行计算：

指标性状的抗旱系数=胁迫下指标性状值/对照下指标性状值

……(1)

U(Xij)=(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)

……(2)

式中，Xij为某一种质某指标的实测值，Xjmax为该指标的最大值，Xjmin为该指标的最小值。U(Xij)为i材料j性状的隶属值。

数据统计与整理采用Excel 2010软件，统计分析采用SPSS 22.0软件。

2 结果与分析

2.1 芽期模拟干旱胁迫最适浓度

由表2可以看出：在PEG-6000浓度为5%、10%、15%时，XW-01、XJ-02、XH-02、XH-05等4份线纹香茶菜及其变种种质种子的发芽率与对照组相比基本无统计学意义。

当PEG-6000浓度升至20%及25%时，4份种质发芽率与对照相比均有统计学意义，但考虑到25%发芽率较低，可能淘汰掉发芽率低但其他萌发指标较优的种质，故选择浓度20%的PEG-6000为芽期胁迫的最适浓度。

2.2 干旱胁迫和对照条件下供试线纹香茶菜及其变种种质各指标的变化

20% PEG-6000浓度下，线纹香茶菜及其变种种子发芽势为8.670 0%～0.000 0%，平均为2.266 7%，较对照下降66.577 8%；发芽率为83.330 0%～16.666 7%，平均为50.888 7%，较对照下降35.466 7%；其他指标也受到不同程度的抑制，其中芽鲜重、芽干重、胚根长、下胚轴长、总芽长均值较对照分别减少0.005 1 g、0.000 2 g、0.444 1 cm、0.036 4 cm、0.488 7 cm，活力指数和发芽指数分别下降8.287 6和0.111 9；相当于对照的44.736 8%、25%、39.021 1%、16.092 0%、36.141 1%、68.737 4%、81.798 2%。由此可知，旱胁迫对于线纹香茶菜及其变种种子萌发的抑制作用表现在多种性状上，且抑制程度存在差异。发芽指数受抑制最大，下降达81.798 2%，活力指数次之，下降达68.737 4%，而下胚轴长受抑制最小，仅下降16.092 0%。此外，处理与对照相比，发芽势、发芽率、鲜重、干重、发芽指数以及活力指数的变异系数均有不同程度的增加，而胚根长、下胚轴长及总芽长的变异系数出现不同程度的降低，其中发芽势的变异系数最大，比对照增加了91.611 9%，是对照的2.54倍；下胚轴长的变异系数次之，比对照减少了62.748 2%，是对照的64.610 3%，说明不同品种的形态指标在干旱胁迫下差异更明显。综上所述，各指标对干旱胁迫反应的敏感性存在差异，直接采用各指标测定值很难鉴定供试种质的抗旱性，需对其进行综合分析和评价。

表2 不同浓度PEG-6000溶液对线纹香茶菜及其变种种子发芽率的影响

注：“*”差异显著(p<0.05))，“**”差异极显著(p<0.01)。

2.3 线纹香茶菜及其变种种质抗旱相关10项萌发指标的抗旱系数

从表3可以看出：15份线纹香茶菜及其变种种质RE、GR、FB、DB、RL、HL、TL、RL/HL、GI、AI的抗旱系数均有较大变幅，变幅分别为0.00～0.10、0.26～0.86、0.32～0.73、0.22～1.60、0.35～2.28、0.4～1.34、0.35～1.79、0.32～2.37、0.12～0.40、0.04～0.29；种子萌发的10项指标对PEG-6000模拟干旱胁迫的敏感程度不同，敏感程度排序为GE>RL/HL>RL>TL>AI>DB>GR>GI>FB>HL；15份种质的10项指标平均值变幅在0.03～1.00之间，变异系数变幅在25.13%～124.60%之间。综上所述，线纹香茶菜及其变种不同种质间的抗旱系数所反映的抗旱性不同，且同一种质各指标的抗旱系数差异较大，说明各指标对干旱胁迫的敏感性不同，直接采用这些指标会由于指标间信息重叠，很难客观、准确地评价各种质的抗旱性，从而影响抗旱性鉴定结果。

2.4 主成分分析

主成分分析特征值中前3个成分的累计贡献率达85.161%，且各成分特征值均大于1(表4)，根据主成分分析成分因子特征值大于1且累计贡献率大于80%的原则，可认为此主成分分析的前3个成分代表了原始10个萌发指标的大部分信息。

表4 线纹香茶菜及其变种种质芽期抗旱相关10项萌发指标的抗旱系数

决定主成分1大小的主要是GE、GR、FB、DB、GI、AI的抗旱系数，主成分1 相当于4.682个原始指标的作用，反映了原始数据信息量的46.824%；决定主成分2大小的主要有RL、TL、RL/HL的抗旱系数，主成分2相当于2.733个原始指标的作用，反映了原始数据信息量的27.329%；决定主成分3大小的主要是HL的抗旱系数，主成分3相当于1.101个原始指标的作用，反映了原始数据信息量的11.008%。

2.5 抗旱性度量值分析

孟生旺认为，主成分分析中的第一主成分综合原始数据信息的能力最强，在多指标综合评价中，应以第一主成分确定各指标的权数[12]。根据抗旱系数计算15份种质指标的隶属函数值(公式2)，以主成分1各指标的特征值作为各指标的权数与之相乘，分种质求和，即得到各种质的抗旱性度量值D(D值，表5)。

D值越大，抗旱性越强，反之越弱。15份种质的D值在0.647 2～5.493 7之间，其中，XJ-01的D值最高，为5.493 7，抗旱性最强；XH-011抗旱性度量值最小，为0.647 2，D值处于较低水平，抗旱性较弱。

2.6 抗旱系数与抗旱性度量值的相关性分析

15份线纹香茶菜及其变种种质10项指标的抗旱系数与D值相关性分析的结果(表6)表明：除GP、HL外，余下8项指标的抗旱系数都至少与1个其他指标的抗旱系数呈显著或极显著相关，说明除GP、HL外的8项指标间存在一定程度的相关性。

10项抗旱系数与D值的相关关系大小排序为AI>GI>GR>FB>GP>DB>HL>TL>RL>RL/HL；其中，GP、GR、FB、GI、AI的抗旱系数与D值呈极显著相关，DB、HL、TL、RL、RL/HL的抗旱系数与D值的相关性均不显著。

表5 线纹香茶菜及其变种各指标主成分的特征向量及贡献率

注：“*”表示该指标在各主成分中的最大绝对值。

图1 15份线纹香茶菜及其变种种质抗旱性度量值的聚类图

表7 抗旱性系数与抗旱性度量值的相关性分析

2.7 15份线纹香茶菜及其变种抗旱性度量值的聚类分析

为了综合评价线纹香茶菜及其变种种质的抗旱性，运用系统聚类法对15份种质的抗旱性度量值进行聚类分析，当平方欧氏距离为1时，其抗旱性可以分为4类(图1)。

XH-07、XH-10、XH-03、XW-01、XH-06等5份种质聚为一类，为Ⅰ类；XH-02、XW-02、XH-05、XH-08、XJ-02等5份种质聚为一类，为Ⅱ类;XH-11、XH-04、XH-01等3份种质聚为一类，为Ⅲ类；XJ-01、XH-09等2份种质聚为一类，为Ⅳ类。根据15份种质的D值可以判断4类线纹香茶菜及其变种种质的抗旱性强弱，依次为Ⅳ类>Ⅰ类>Ⅱ类>Ⅲ类，可划分为高抗型、中抗型、抗型、抗性敏感型。

3 讨论与结论

本研究使用PEG-6000溶液模拟干旱胁迫最适浓度筛选参照绿豆[13]等筛选芽期抗旱性鉴定的方法，此类粮食作物抗旱性研究众多，方法应用较广泛；在线纹香茶菜及其变种各种质抗性未知的情况下，选取线纹香茶菜、变种纤花线纹香茶菜、变种狭基线纹香茶菜等4份种质进行芽期抗旱最适PEG-6000浓度的探索，初步确定了芽期模拟抗旱鉴定的最适PEG-6000浓度为20%。此法存在一定误差，可在后期得出芽期抗旱性鉴定结果后，再利用已知抗性种质进行芽期抗旱最适PEG-6000浓度的探索，以验证初期浓度筛选结果。

种子萌发是植物生长过程中的重要阶段，也是衡量植物抗旱性强弱的重要时期[14]。干旱胁迫下，线纹香茶菜及其变种种子萌发会做出响应，不同萌发指标对干旱胁迫的敏感度不同，通过单一指标对抗旱性进行评价存在片面性、局限性和不稳定性；目前普遍认为，隶属函数法、主成分分析法、聚类分析法等多指标多方法相结合的抗旱性综合评价更加真实、可靠，采用多指标多方法结合综合评价植物抗旱性已成为抗旱性鉴定方法的主流[15]，此法已应用在大豆[16]、谷子[17]、偃麦草[18]、棉花[19]、玉米[20]、甜瓜[21]等众多作物抗旱研究上。故本研究选取与线纹香茶菜及其变种芽期抗旱相关的RE、GR、FB、DB、RL、HL、TL、RL/HL、GI、AI等10项萌发指标，基于抗旱系数，结合隶属函数法、主成分分析法、抗旱性度量值法和聚类分析法综合评价15份线纹香茶菜及其变种种质的抗旱性，其抗性强弱排序为XJ-01、XH-09>XH-07、XH-10、XH-03、XH-06、XW-01>XH-02、XW-02、XH-08、XH-05、XJ-02>XH-11、XH-04、XH-01。综合评价结果将15份线纹香茶菜及其变种种质分为4个抗旱类型，初步筛选出XJ-01、XH-09共2份芽期抗旱性较强的种质，同时，筛选出GP、GR、FB、GI、AI作为线纹香茶菜及其变种芽期耐旱性评价指标。

从不同种质类型的角度分析，线纹香茶菜属于柔弱草本，茎较柔软，常匍匐于地面生长，而其2个变种的茎常直立生长，茎相对较壮硕；抗旱性鉴定结果显示，抗旱性强的种质包括1份狭基香茶菜(XJ-01)和1份纤花香茶菜(XH-09)，说明线纹香茶菜对干旱胁迫的敏感程度相比其2个变种要强烈；本研究在前期种质资源调查收集的过程中发现，线纹香茶菜与狭基香茶菜的野生种群较少，而纤花香茶菜的野生资源则较为多见，推测可能与纤花香茶菜在野生状态下遭GP、GR、FB、GI、AI遇水分胁迫时抗逆能力较强有关。遭受干旱胁迫时，植物抵抗逆境的方式有2种，分别是御逆性和耐逆性，其抗性强弱取决于遗传潜力和抗逆锻炼，抗逆锻炼是指植物在逆境下形成对逆境适应和抵抗力的过程，即生产上的人工驯化过程。从不同生境类型来看，线纹香茶菜及其变种的野生种群常成丛生于河岸、溪旁、田边、草丛、林下等阴湿处，泥土松软含腐殖质多，生境地能供给植株生长所需水分且营养十分充足，而大田栽培种群多种植在宽阔的山下平地上，植物生长的水分来源主要依靠人工灌溉，大田种植的地块多为黄土地，泥土较板实，生长期需定期施肥来提供营养；野生居群和栽培居群的植物根系特征相差也较大，前者根系不发达须根较少，后者根系发达须根较多；本研究结果表明，芽期抗旱性较强的XJ-01和XH-09分别来自广州中药研究所和清远英德，是栽培多年的种群，它们生境地的水分条件均较野生种群的差，推测可能是XJ-01与XH-09在人工栽培过程中种质的抗旱性得以驯化增强；本实验的野生种群种子的芽期抗旱性均较差，可能是由于它们长期生长在充足水分生境下，因而对干旱胁迫较敏感。综上所述，这种野生资源分布及长势上的差异性，推测有可能与其抗旱性特性的差异有关。今后可以结合苗期抗旱性鉴定与抗旱生理研究结果进一步分析探讨线纹香茶菜及其变种的抗旱特性，为抗旱性优良种质的筛选奠定基础，还可进一步研究能否通过人工驯化增强线纹香茶菜及其变种的抗旱性。