多花黄精种子萌发过程的形态和解剖研究

22

(1.贵州大学农学院，贵阳 550025；2.贵州省药用植物繁育与种植重点实验室，贵阳 550025)

多花黄精(PolygonatumcyrtonemaHua.)是中药材黄精(PolygonatiRhizoma.)的基源植物之一，用于脾胃气虚、体倦乏力、胃阴不足、口干食少、肺虚燥咳、劳嗽咳血、精血不足、腰膝酸软、须发早白和内热消渴等方面[1]。多花黄精主产于贵州、湖南、云南、浙江、安徽等省[2]。近年来，黄精因其独特的药食同源性质而具有较高的经济价值，市场对黄精原料的需求量日益增加[3]，野生资源远远满足不了市场需求[3]。多花黄精人工栽培中通常用块茎进行无性繁殖。长期的无性繁殖导致黄精品种质量的恶化[4]。利用种子进行有性繁殖成为解决品种质量恶化的有效方法，但因其种子萌发周期长，要经历2个冬季休眠才能长出第1片真叶，导致人工大规模种子育苗遇到困难[5-6]。

黄精(PolygonatumsibiricumRed.)、多花黄精(PolygonatumcyrtonemaHua.)与滇黄精(PolygonatumkingianumColl.et Hemsl.)同属百合科黄精属植物。百合科药用植物种子质地坚硬,有许多种的种子存在休眠现象[7]。黄精种子具有形态生理休眠的特性[8]。滇黄精种子具有形态休眠特性[9]。但是关于多花黄精种子休眠原因的研究较少，因此有必要了解多花黄精种子萌发过程中的形态变化及解剖特征，为解除其种子休眠及促进种子萌发提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

于2018年10月下旬采自贵州大禹王农业发展有限公司黄精种植基地，种植年限为5年，经贵州大学生命科学院赵财副教授鉴定为多花黄精PolygonatumcyrtonemaHua.。清水中洗去外种皮，在阴处晾干水分，备用。

1.2 方 法

1.2.1种子处理

种子4 ℃沙藏4个月以后洗净，置于铺有2层滤纸的培养皿中，润湿滤纸，放入人工气候箱中黑暗条件下进行培养，温度设置为28 ℃。

1.2.2种子萌发过程形态观察

在低温沙藏过程中，每隔1月测定多花黄精种子百粒重；选取每个阶段种子50粒测定种子长、宽、厚；选取各阶段种子30粒测量胚长和胚乳长，计算胚率(胚率=胚长/胚乳长)，胚长与胚乳长在Nikon-SMZ 800体式显微镜下测量；种子纵径和横径用电子数显游标卡尺测量。从种子露白开始，每天观察、照相，每隔1 d定株观察并拍照种子从胚露白到初生根茎形成的形态变化过程。

取萌发过程中形态变化大的种子制作石蜡切片。具体步骤如下：1) 固定：用70%FAA固定液固定48 h；2) 脱水：将固定液倒去，依此加入70%酒精、85%酒精、95%酒精、100%酒精、100%酒精，时间为1 h；3) 透明：依次加入1/2二甲苯+1/2纯酒精番红饱和溶液(4 h)、二甲苯(1 h)、二甲苯(1 h)、1/3二甲苯+2/3石蜡屑(40 ℃过夜)；4) 包埋、修块、切片、贴片；5) 脱蜡：烘干后的切片一次放入二甲苯(20 min)、二甲苯(20 min)、1/2二甲苯+1/2无水乙醇(10 min)、100%酒精(10 min)、0.5%固绿染液(20 s)、95%酒精(2 s)、100%酒精(5 min)、1/2二甲苯+1/2无水乙醇(5 min)、二甲苯(5 min)、二甲苯(2 min)[10]。

2 结果与分析

2.1 多花黄精种子萌发过程表观形态特征

2.1.1多花黄精种子萌发过程阶段的划分

通过体式显微镜观察多花黄精种子萌发的形态变化，将其分为6个阶段：刚采摘、未萌发、刚萌发、小球茎形成、初生根茎形成和出苗。

2.1.2多花黄精种子萌发过程外部形态特征

刚采摘的多花黄精种子外观呈不规则卵圆形，具蜡质，亮黄色，种皮外附有绿色物质，无法完全洗去；种脐为种子与果实连接断裂处，呈放射状，黑褐色(图1 A)；种脐对面为种孔，呈黑褐色圆点状。经过4个月的低温沙藏，种皮外附有的绿色物质褪去，出现裂纹(图1 B)；胚伸长到种孔处，种孔有明显凸起(图1 C)。低温沙藏处理结束后，将种子放在人工气候箱黑暗条件下进行培养，10 d后多花黄精种子开始萌发(图1 D)。种子萌发后第8天时形成肉眼可见的膨大部位，称之为“小根茎”[11]，小根茎和种子通过子叶联结连接，另一端伸出主根，与主根垂直的地方形成芽(图1 E)，种子萌发后第11天开始陆续伸出第1侧根、第2侧根等(图1 F)。种子萌发后第35天，初生根茎基本形成(图1 G)，种子萌发后第50天，芽开始伸长，尖端呈绿色(图2 G)。

2.1.3多花黄精种子萌发过程形态变化

从表1可知，多花黄精种子百粒鲜重在低温沙藏前为3.92 g，低温沙藏1个月后，种子重量为4.20 g，增加了7%，与低温沙藏前差异达到极显著水平，之后种子百粒重无显著差异。低温沙藏结束后，种子开始大量吸水，种子萌发时，百粒重为6.44 g；小根茎形成时，百粒重为8.28 g；初生根茎基本形成时，百粒重为9.90 g；出苗时，百粒重为9.90 g。

对种子长、宽和厚的测量表明，种子低温沙藏1个月后，种子的长有极显著增长，由4.16 mm增至4.36 mm，之后3个月低温沙藏中，种子大小无显著变化，种子低温沙藏结束后迅速吸胀，长、宽和厚均极显著增长，其中种子长由4.39 mm增至4.71 mm，种子宽由4.54 mm增至4.73 mm，种子厚由3.70 mm增至3.92 mm，之后种子大小基本无显著变化。

2.2 多花黄精种子萌发过程解剖结构变化

2.2.1多花黄精种子低温沙藏过程胚率的变化

种子解剖结果显示，刚采摘的多花黄精种子由种皮、胚乳和胚3部分组成(图2 A)，其中胚乳占种子体积的大部分，胚被胚乳和种皮包被，胚率约为45.12%；种子经过低温沙藏处理，种胚增长比较缓慢，低温沙藏4个月种子，胚伸长到种孔处(图2中B)，胚率为47.39%，同刚采摘的种子胚率相比显著增加。

表1 多花黄精种子形态变化(平均值±标准差)

注：同列不同小写字母表示在0.05水平上差异显著，大写字母表示0.01水平上差异极显著。

注：A为多花黄精种子种脐；B为低温沙藏后种子(种皮绿色褪去，种皮龟裂)；C为低温沙藏后种子种孔(种孔向外凸出)；D为萌发1 d时种子；E为萌发3 d时种子；F为萌发12 d时种子；G为萌发35 d时种子。Hi为种脐；Sc为种皮；Mi为种孔；Ra为胚根；Ge为胚芽；Cp为子叶联结。

图1 多花黄精种子萌发过程表观观察

2.2.2多花黄种子萌发过程胚乳变化

多花黄精种子的胚被胚乳包裹，经过4个月的低温沙藏，种孔附近的胚乳降解，胚伸长到靠近种孔(图2中B)。开始萌发后，胚从种孔伸出(图2中C)，种子萌发后第3天，胚全部伸出种子(图2中D)，通过吸器连接种子内外结构。随着萌发时间的后延，吸器不断膨大，胚乳面积逐渐减小，且吸器和胚乳之间有过渡层(图2中E～G)，此过程为胚乳弱化[12]，胚乳中的营养物质被吸器吸收转移，用于种子的萌发生长。

2.2.3多花黄精种子萌发过程中的各结构的显微结构特征

多花黄精种子萌发前，胚无明显分化，结构简单，没有胚芽、胚轴、胚根和子叶的分化，呈棒状，处于棒型胚时期(图2中H)。子叶联结有2束维管束，1束连接胚根，1束连接胚芽(图2中I，J)，给胚芽和胚根的生长发育提供营养物质，此现象与黄精相同，与滇黄精不同[8-9]。随着种子的不断生长，吸器逐渐变大，呈头状结构(图2中F)，吸器与子叶联结连接部分的细胞细长(图2中K);对吸器进行纵切，观察到中轴部分的细胞细长，形成维管束(图2中L)。胚芽分化过程中子叶鞘有舌状鞘的分化(图2中M)，舌状鞘发育良好，对胚芽具有更好的保护作用[13]。对主根进行纵切，观察到主根有1束维管束(图2中N)。

3 结论与讨论

3.1 多花黄精种子萌发过程特点

3.1.1多花黄精种子萌发过程表观形态特征

通过体式显微镜观察多花黄精种子萌发的形态变化，将其萌发的形态分为：刚采摘、未萌发、刚萌发、小球茎形成、初生根茎基本形成和出苗阶段。

种子萌发过程包括快速吸水、缓慢吸水、吸水停滞和后萌发4个阶段[14]。本研究表明，低温沙藏处理1个月，多花黄精种子重量显著增加，继续低温沙藏处理3个月，种子重量无显著变化。结果显示，低温沙藏处理1个月，多花黄精种子在经历快速吸水、缓慢吸水后可能处于吸水停滞阶段；后3个月，种子处于吸水停滞阶段；低温沙藏处理结束后，种子开始萌发，经历刚萌发、小球茎形成、初生根茎基本形成和出苗阶段，在这5个阶段中，种子重量均显著增加，处于后萌发阶段。

3.1.2多花黄精种子萌发过程解剖结构变化

通过解剖不同萌发时期的多花黄精种子发现，刚萌发的多花黄精种子胚被厚厚的胚乳包裹。低温沙藏4个月后的种子，胚与种孔间的胚乳降解，胚生长到种孔处。随着种子的萌发，胚乳面积逐渐减小，吸器面积逐渐增大，可能是胚乳降解产生的营养物质被吸器吸收运输到子叶联结，作用在小根茎生长上。

种子发芽的可见标志一般是包被胚的组织被胚根穿破[15]。本研究发现，刚采摘的多花黄精种子胚分化不明显，结构简单。随着种子的不断萌发，形成肉眼可见的膨大部位，多花黄精的胚根和胚芽在此处分化。通过对“小根茎”与种子中间部分进行显微观察，发现该部分有2束维管束，一束向上连接胚芽，一束向前连接胚根，所以“小根茎”与种子中间部分并不是胚根，而是子叶联结，因此多花黄精种子的发芽标志并不是胚根突破种皮，而是子叶联结先突破种皮，随后在子叶联结上分化出胚根和胚芽，故形态成熟的多花黄精种子，其胚未分化出明显的子叶、胚芽和胚根，随着种子的萌发而分化成成熟胚，这种现象与黄精种子[13]一致。

3.2 多花黄精种子具有形态生理休眠特点

种子休眠是指具有生活力的种子在适宜的萌发条件下仍然不能萌发的现象[16]。Baskin等[17]将种子休眠分为物理休眠(physical dormancy,PY)、生理休眠(physiological dormancy,PD)、形态休眠(morphological dormancy,MD)、复合休眠(PY+PD)和形态生理休眠(morphophysiology dormancy,MPD)5个种类。本研究显示，刚采收的多花黄精种子的种皮具蜡质，亮黄色，种皮外附有绿色物质，无法完全洗去，种皮的厚度和结构可以影响种子的透气性和透水性[18]。将采收后的多花黄精种子进行低温沙藏处理，1个月后种子重量显著增加，说明种皮的具蜡质结构并没有对种子的吸水萌发造成影响。刚采摘的多花黄精种子的胚被厚厚的胚乳包裹，胚乳在支撑胚生长方面起着非常重要的作用，通过提供营养物质，保护胚并控制胚生长，在种子发育和萌发过程中作为机械屏障[19]。在低温沙藏过程中，多花黄精种子的胚在缓慢向种孔生长，低温沙藏4个月后，胚与种孔间的胚乳降解，胚生长到种孔处，种孔有明显凸起。许多植物种子存在大而坚硬的胚乳，其萌发过程中单纯依靠胚根细胞的伸长生长还不足以突破坚硬的胚乳组织，萌发的完成还需要胚乳自身进行弱化[15]，说明多花黄精种子萌发需要胚乳自身进行弱化，进而说明多花黄精种子的休眠与胚乳的限制有关，故多花黄精种子存在生理休眠。有研究表明，多花黄精种子休眠属于胚本身原因引起的休眠[20]。对刚采摘的多花黄精种子胚进行解剖学观察，其结构简单，分化不明显，呈棒状，处于“棒型胚”时期，这与黄精种子一致[13]，这样的结构说明多花黄精种子存在一个形态后熟阶段，这种结构是造成多花黄精种子萌发缓慢的原因之一，故多花黄精种子存在形态休眠。综上所述，多花黄精种子具有形态生理休眠特性。

注：A为低温沙藏前的种子纵切；B为低温沙藏后种子纵切(胚接近种孔)；萌发后不同时期种子内部胚乳观察：C为萌发1 d时种子；D为萌发3 d时种子；E为萌发8 d时种子(箭头所指为2种不同类型的胚乳)；F为萌发30 d时种子；G为萌发50 d时种子。H～N多花黄精种子解剖结构：H为胚纵切；I为子叶联结横切(图中可见两束维管束)；J为子叶联结纵切(两束维管束，一束向上连接胚芽，一束连接胚根)；K为吸器纵切；L为吸器中轴纵切(箭头所指为吸器中不同类型细胞)；M为胚芽纵切；N为主根纵切(一束维管束)。Vb为维管束；Ha为吸器；Cp为子叶联结；Ls为舌状鞘。

图2 多花黄精种子萌发过程解剖观察

3.3 多花黄精种子萌发成苗快慢问题

本实验研究了多花黄精种子萌发过程中的形态变化及解剖特征，但是萌发成苗时间长的问题仍待解决。有研究表明，种胚形态未成熟和胚乳吸水障碍，是黄精种子休眠的主要原因[8]。胚乳弱化是黄精种子能否萌发的最后开关[21]。胚乳弱化包括细胞壁的酶促和非酶促松弛机制[22]。ABA抑制种子萌发是因为ABA抑制了胚的生长，内向外“顶”的力量缺失,种子就无法完成萌发[23]。根据本研究的结果，对促进多花黄精种子萌发成苗的措施提出3点设想：一是去除多花黄精种子种孔处胚乳能加快多花黄精种子萌发成苗；二是提高细胞壁降解酶活性能加快多花黄精种子萌发成苗；三是降低ABA含量能加快多花黄精种子萌发成苗。