肉荚云实果壳化学成分的研究*

刘 留，徐文芬，何顺志，张天伦

(贵阳中医学院，贵州 贵阳 550002)

肉荚云实CaesalpiniadigynaRottle为豆科Leguminosoe云实属CaesalpiniaL.植物，主要分布于南亚一带的印度、越南、马来西亚以及中国大陆的海南、云南等地，多生长于海拔500 m左右的山坡灌丛中和海边。通过现代研究发现，云实属的植物中含有萜类、黄酮类、生物碱、单宁、氨基酸等多种化学成分，多具有抗炎、抗病毒、抗癌、抗疟疾等药理作用，但是其质效关系尚不明确。为更好的对肉荚云实进行深入的药理研究以及对其进行质量控制，我们对肉荚云实果壳所含化合物进行较为系统的研究。本实验报道从肉荚云实果壳乙醇提取物的乙酸乙酯部位中分离、鉴定得到10个化合物，分别为(1)4’-羟基二氢黄酮、(2)甘草素、(3)β-谷甾醇、(4)熊果酸、(5)没食子酸乙酯、(6)没食子酸甲酯、(7)没食子酸、(8)鞣花酸、(9)对二没食子酸、(10)胡萝卜苷。其中化合物(1)为首次从云实属植物中提取得到，其余均首次从本植物中分离得到。

1 材料

1.1 仪器

XT-4型双目显微熔点测定仪(北京泰克仪器有限公司)；JEOL ECX-500核磁共振波谱仪(日本电子株式会社)，TMS为内标物；5973 MSD质谱仪(美国安捷伦公司)；VECTOR22傅里叶变换红外光谱仪(德国BRUKER仪器公司)；HP8453紫外可见分光光度计(美国惠普公司)。薄层用硅胶GF254及柱层析硅胶均为青岛海洋生化试剂厂生产。所用试剂均为分析纯。

1.2 样品来源

肉荚云实由作者采摘自海南三亚，由贵阳中医学院何顺志教授鉴定为豆科云实属植物肉荚云实Caesalpiniadigyna的果实，晒干，去籽。

2 方法与结果

2.1 提取与分离

取干燥肉荚云实果壳粗粉18.6 kg，以2倍量95%乙醇冷浸提取两次，每次72 h。提取后的残渣用1倍量95%乙醇超声提取(40 kHz)两次，每次30 min。合并提取液，减压浓缩后得到总浸膏。将总浸膏用水分散后，依次使用石油醚(60～90 ℃)、乙酸乙酯以及正丁醇萃取。回收溶剂后，取乙酸乙酯浸膏630 g，经硅胶柱色谱，石油醚-乙酸乙酯=9∶1→0∶1梯度洗脱，TLC检测后合并主斑点一致或相近的流分，最后共得到13个流分。

取流分1、2、3，均使用正相硅胶柱色谱纯化，分别以石油醚∶丙酮 = 9∶1、8∶1以及石油醚∶乙酸乙酯 = 4∶1洗脱，所得化合物在甲醇溶液中重结晶，得到化合物1、2和3。流分4使用正相硅胶柱色谱分离，石油醚∶乙酸乙酯梯度洗脱(1∶0，9∶1，6∶1)，得到两个亚流分，分别用甲醇溶解，重结晶，得到化合物4以及化合物5。流分6使用适量丙酮加热溶解后，缓慢滴加氯仿至刚出现沉淀，放置重结晶后得到化合物6。流分9使用制备薄层色谱分离，氯仿∶甲醇 = 5∶1展开，每2毫升展开剂滴加1滴甲酸，色带2经氯仿重结晶后得到化合物7。流分10使用正相硅胶柱色谱分离，石油醚∶丙酮梯度洗脱(6∶1→3∶1)，收集第二亚流分在丙酮-氯仿溶液中重结晶，得到化合物8。流分11浓缩后析出土黄色无定型沉淀，过滤收集沉淀得到化合物9。流分13使用正相硅胶柱色谱纯化，氯仿∶甲醇 = 9∶1，每100毫升滴加4滴甲酸洗脱，所得化合物经丙酮溶解，滴入氯仿过饱和后得到化合物10。

2.2 结构鉴定

化合物1：为黄色针晶(甲醇)，熔点182～184 ℃，盐酸镁粉反应呈阳性。易溶于氯仿、甲醇。KBr压片IR显示在1665 cm-1处有吸收，证明其含有羰基；ESI-MS m/z：240；EI-MS m/z：223[M-OH]+，211[M-CHO]+，77[C6H5]+，91[C7H7]+，以上可判断出该化合物为带有取代基的苯环以及酚性结构，104[C6H4+CO]+，136[M-C7H4O]+，124[M-C7H4O-H2O]+，114[M-C7H4O-CO]+，163[M-C6H5]+，据此可以推断，该化合物结构应该有两个苯环，一个带有酚羟基，而另一个带有的CO根据IR显示应该为羰基，初步估计为黄酮类化合物。

1H-NMR(500 MHz，CDCl3+acetone-d6)δ：5.55 ppm(1H，dd，Jcis= Ca.5 Hz，Jtrans=Ca.11 Hz，H-2)，2.78 ppm(2H，q，J偕=17 Hz，J邻=5 Hz，H-3)，推断其可能为二氢黄酮类化合物；9.35 ppm(1H，s，4’-OH)，6.45 ppm(1H，d，J = 8.4 Hz，3’，5’-H)，7.30～7.50 ppm(3H，c，6，2’，6’-H)，6.57 ppm(1H，dd，J = 1.9 Hz，8-H)，7.51(1H，d，J = 8.6 Hz，5-H)以及7.76(1H，t，7-H)。

13C-NMR(125 MHz，CDCl3+acetone-d6)呈现13个碳原子信号，推测有对称结构导致信号重叠；DEPT谱显示没有甲基信号但有1个亚甲基，4个未被增益的季碳原子；δ44.19 ppm(C-3)为DEPT谱上所显示的亚甲基信号，推测其为二氢黄酮C环上的3位碳原子信号；4个季碳原子分别为：δ190.32 ppm(C-4)推测为因氧原子和苯环而强烈移向低场的C环上4位的苯甲酰碳原子，δ164.65 ppm(C-4’)与δ163.50 ppm(C-9)推测为B环上带羟基的4’位碳及A环上带醚键的9位碳，δ139.05 ppm(C-10)推测为连有羰基的10位碳原子信号；δ103.02 ppm(C-3’，C-5’)以及δ126.13 ppm(C-2’，C-6’)各为2个碳原子信号重叠，推测为因对位双取代而呈对称结构的B环上的碳原子信号，δ128.81 ppm(C-1’)推测为B环与C环相连的1’位碳原子信号；δ110.79 ppm(C-8)，δ128.49 ppm(C-6)，δ128.63 ppm(C-7)，δ114.08 ppm(C-5)为A环上剩余碳原子信号。根据以上光谱数据可以推断得到，该化合物为4’-羟基二氢黄酮(4'-hydroxyflavanone)，该化合物首次从云实属植物中分离得到。

化合物2：为黄色针晶(甲醇)，熔点196～198 ℃。ESI-MS m/z：256，EI-MS m/z：255[M-H]+，239[M-OH]+，163[M-C6H5]+，91[C7H7]+。1H-NMR(500 MHz，CDCl3+acetone-d6)δ：5.49 ppm(1H，dd，Jcis=Ca.5 Hz，Jtrans=Ca.11 Hz，H-2)，3.01 ppm(2H，q，J偕=17 Hz，J邻=5 Hz，H-3)推断其可能为二氢黄酮类化合物；其谱图与化合物(1)大致相同。13C-NMR(125 MHz，CDCl3+acetone-d6)谱也与化合物(1)相似，DEPT谱δ164.20 ppm出现第5个未被增益的季碳原子；其剩余碳谱数据：189.59 ppm(C-O)，162.71 ppm(C-8a)，157.20 ppm(C-4’)，128.91 ppm(C-1)，128.20 ppm(C-5)，128.00 ppm(C-2’)，127.80 ppm(C-6’)，115.10 ppm(C-5’)，115.00 ppm(C-3’)，110.20 ppm(C-6)，113.40 ppm(C-4a)，102.20 ppm(C-8)，79.20 ppm(C-2)，44.20 ppm(C-3)，以上光谱数据与文献[1]报道基本一致，推断该化合物为甘草素(Liquiritigenin)。

化合物3：为白色针晶(乙酸乙酯)，熔点133～135℃，5%的硫酸乙醇下显紫红色，Liebermann - Burchard反应呈现阳性结果。易溶于氯仿、甲醇。EI-MS m/z：414[M]+，396 [M-H2O]+，55(环烯烃RDA反应特征峰)以及255，213，145，107，81，69，43等甾醇化合物的特征离子峰。1H-NMR谱(500 MHz，CDCl3)与文献[2]报道基本一致，故推断该化合物为β-谷甾醇。

化合物4：为白色粉末(甲醇)，熔点280～283 ℃，5%的硫酸乙醇下显紫红色，Liebermann-Burchard反应呈现阳性结果。1H-NMR谱 (500 MHz， pyridine-d5)与文献[3]报道基本一致，并且该样品使用TLC与熊果酸标准品对比，其Rf值与斑点颜色完全一致，确定该化合物为熊果酸。

化合物5：为白色粉末(乙酸乙酯)，熔点148～150 ℃。ESI-MS m/z：197[M-H]+；EI-MS m/z：153[C7H5O4]+，170[C7H6O5]+，125[C7H5O4-CO]+，79[C7H7]+。KBr压片IR提示有成酯的羰基存在。1H-NMR(500 MHz，acetone-d6)δ：1.34 ppm(3H，t，J =7 Hz，-CH3)，4.28 ppm(2H，q，J = 7 Hz，O-CH2-)，7.16 ppm(2H，s)。以上光谱数据与文献[4]报道基本一致，确定该化合物为没食子酸乙酯。

化合物6：为白色棱状方晶(乙酸乙酯)，熔点201～203 ℃。EI-MS m/z：184[M]+，153[C7H5O4]+，139[M-OH-H2O]+，125[C7H5O4-CO]+，79[C7H7]+等没食子酸特征碎片离子，提示该化合物可能为没食子酸类衍生物。KBr压片IR提示有成酯的羰基存在。1H-NMR(500 MHz，acetone-d6)δ：3.79 ppm(3H，s，O-CH3)，7.12 ppm(2H，s)。以上光谱数据与文献[5]报道基本一致，确定该化合物为没食子酸甲酯。

化合物7：为白色粉末(丙酮)，熔点238～240 ℃，溴酚蓝反应显黄色，EI-MS m/z：170[M]+，153[M-OH]+，135[M-OH-H2O]+，142[M-CO]+，114[M-2CO]+，125[M-CO-OH]+，107[M-CO-OH-H2O]+，79[C6H7]+。1H-NMR(500 MHz，acetone-d6)δ7.10 ppm(2H，s)。13C-NMR(125 MHz，acetone-d6)δ：167.12 ppm(C-1)，109.80 ppm(C-3，C-7)，122.10 ppm(C-2)，138.11 ppm(C-5)，146.15 ppm(C-4，C-5)。以上光谱数据与文献[6]报道基本一致，确定该化合物为没食子酸。

化合物8：为白色方晶(丙酮)，ESI-MS m/z：323[M+1]+。EI-MS m/z：171，153，79。1H-NMR(500 MHz，acetone-d6)δ：7.09(2H，s)，7.26(2H， s)。13C-NMR(125 MHz，acetone-d6)δ：165.12 ppm(C=O’)，109.12 ppm(d，C-2’，C-6’)，145.12 ppm(s，C-3’，C-5’)，139.12 ppm(s，C-4’)，165.22 ppm(C=O)，128.02 ppm(s，C-1)，以上光谱数据与文献[7]报道基本一致，确定该化合物为对二没食子酸。

化合物9：为土黄色无定型粉末(甲醇)，微溶于甲醇，易溶于二甲亚砜，熔点大于360 ℃。EI-MS m/z：302[M]+，284[M-H2O]+，273[M-CHO]+，256[M-CO-H2O]+，246[M-2CO]+，228[M-2CO-H2O]+，218[M-3CO]+，190[M-4CO]+，77[C6H5]+；151[C7H3O4]+以及172[C7H8O5]+为没食子酸结构特征碎片。1H-NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：7.34 ppm(2H，s，H-4，H-9)，10.65 ppm(1H，s，-OH)。13C-NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：159.50 ppm，148.10 ppm，139.58 ppm，110.20 ppm，136.38 ppm，112.30 ppm，108.60 ppm。以上光谱数据与文献[8]报道基本一致，确定该化合物为鞣花酸，即联二没食子酸内酯。

化合物10：为白色粉末(甲醇)，5%硫酸-乙醇下显紫红色，放置后变灰绿色，Liebermann-Burchard反应呈阳性，Molish 反应呈阳性。熔点292～294 ℃。其1H-NMR数据与13C-NMR数据与文献[9]上的报道基本一致，且与对照品胡萝卜苷在TLC上的Rf值以及显色情况完全一致，因此确定该化合物为胡萝卜苷。

3 讨论

本研究所得最多的化合物为没食子酸及其衍生物，据文献报道，云实属植物中特征性成分为卡斯烷型二萜以及高异黄酮类化合物居多。近年来一些英国学者从大托叶云实Caesalpiniacrista中分离得到5个新的呋喃并卡斯烷(furanocassane)型二萜类化合物还分得2个新的去甲卡斯烷型二萜化合物norcaesalpinin D和E，国内也有学者从小叶云实Caesalpiniamillettii中分离得到高异黄酮类化合物如怪柳黄素-3-O-(6″-O-E-咖啡酰基)-β-D-半乳糖苷，8-methoxyisobonducellin等。本实验未能获得二萜及高异黄酮，仅得一个二氢黄酮，可能是受提取药材部位(果实)的影响，目前对云实属植物化学成分的研究，多以其根和地上部分，所以是否分离出高异黄酮和二萜与药用部位之间的关系还有待进一步研究。