载体固定化酶的应用及前景展望*

刘雪凌，林 贝

(燕京理工学院，河北 三河 065201)

20世纪60年代，酶固定化技术作为一种新技术发展迅速。这种技术可以在一定的空间范围内将水溶性酶用物理或化学方法处理，使之成为不溶于水状态，从而能反复和连续使用[1]。酶固定化技术使酶的稳定性增加，易从反应系统中分离，易于控制，便于运输和贮存，有利于自动化生产，有广阔的应用前景。

根据载体的有无可以将固定化酶分为载体固定化酶和无载体固定化酶。本文仅对载体固定化酶进行论述。

1 固定化酶载体的选择特点

将酶固定在不溶性聚合物或无机载体上，因此该项技术被称为载体固定化酶技术。其中，载体的种类、理化性质等都会对此技术造成影响[2]。

适宜的载体能够提高载体固定化酶技术的使用效果，因此对载体进行选择非常重要。

其选择特点如下：考虑载体的理化性质，比如形状、大小、孔径、机械强度、能否耐酸碱腐蚀、能否耐高温、能否耐微生物降解等；在载体材料方面，要考虑其材料是否价廉易得，能否进行工业化大生产等；能否再生循环使用，可以降低成本，节能减排[3]等。

2 载体类型

2.1 传统载体

传统载体主要是动植物的结构蛋白，为天然高分子产物，例如可以从虾的甲壳中可以提取壳聚糖、甲壳素[4]；从海藻中可以提取海藻酸钠等。常用的传统载体除了壳聚糖、甲壳素、海藻酸钠外[5]，还包括琼脂糖凝聚、卵清蛋白、琼脂糖珠、木质纤维[6]等。

这些载体的应用可以延长酶的寿命，提高酶的稳定性，可以多次回收反复利用，其酶的固定化工艺简单易行；缺点是载体需要从大量原料中提取制备，材料机械性强度差，易被微生物分解，载体寿命比较短，可重复利用次数少。

2.2 新型载体

2.2.1 人工合成高分子材料

天然高分子可以通过修饰或者由化学手段人工合成高分子材料作为固定化酶的载体，其性能更加优秀。环氧树脂进行化学修饰后成为功能性环氧树脂，可以使固定化酶提高性能[7]；阴离子交换树脂D202固定酶后，可以提高酶的活性，可连续使用28批次[8]；D380树脂固定酶后，重复使用6次，酶活力仍可达到48.9%；聚苯乙烯二乙烯苯树脂和D001树脂也常被用来磷脂酶的固定；D3 11离子交换树脂固定酶后，底物转化率可高达91.3%[9]。

人工合成高分子材料载体可以大规模生产，机械性强度较高，理化性质确定；缺点是与酶分子结合不牢固，容易脱落，其材料的生物相容性比较差，有细胞毒性，因此，其发展受到一定的限制。

为了避免以上缺点，人们尝试将天然高分子材料与人工合成高分子材料通过物理或者化学手段形成复合材料。复合材料可以由两种或者两种以上材料合成，通过复合效应产生原材料不具备的新性能。常见的复合材料包括天然高分子复合载体、合成一天然高分子复合载体以及无机-有机复合载体等。

海藻酸钠、壳聚糖和明胶进行组合是天然高分子复合载体[10]最常见的一种复合方法，其固定酶后比单一性载体的稳定性高；也可以将纤维素衍生物醋酸纤维与聚四氟乙烯基膜[11-12]制成合成-天然高分子复合载体，更加有利于酶的固定。

2.2.2 无机新型材料

传统的无机材料大多是从自然界直接获得或者联合其它物质制成的材料。它的优点是价廉易得、机械强度大、抗酸碱、抗有机溶剂、抗微生物分解等；缺点是其结构不好控制，固定酶的能力较差。

随着科技发展，近些年来开发了很多新型无机材料，比如纳米材料、介孔材料等，这些变化使无机材料具有了很多新的优异性能。

纳米材料有很多优点，它们粒径小，比表面积较大，表面结合能较大，可以容易与酶结合稳定，还能很好提高酶的负载量和酶的稳定性[12]。在生物医学比如临床诊断、靶向药物和酶标中、在细胞学特别是细胞符号及细胞别离中、在生物工程的酶固定化中均可使用磁性纳米材料，一般应用各种基团如-COOH、-CHO、-OH、-NH以及-SH等形成功能性分子[13]。磁性可以对使用的纳米载体进行回收，提高商品的纯度。常用的Fe3O4纳米粒子通过不同链长的烷基硅烷修饰形成新型磁性纳米材料；Fe3O4纳米粒子还可以与聚乙二醇聚合，使酶固定性能进行改善[14]。除此之外，磁性纳米材料还包括二氧化硅纳米粒子、磁性纤维素纳米晶体、磁性氧化氮纳米颗粒等。磁性纳米材料载体不仅有磁性特点，还有纳米材料的有点，因此发展迅速。 碳基纳米复合材料是近年来发展起来的又一新型纳米材料载体。由石墨烯制成的复合材料超薄，其导热性能、机械强度、化学稳定性、生物相容性方面都具有优良性能。其中，氧化石墨烯及其衍生物可以吸附金属氧化物和固定酶。碳纳米管具有良好的导电性能、吸附性能、生物相容性等，也被广泛应用在酶固定上[15]。

无机新型介孔材料具有有序孔道结构、容易进行修饰、孔径分布较窄、比表面积大、孔隙率高和机械稳定性好等优点[16]。此类载体常为介孔硅胶材料。应用表面活性剂液晶模板法可以制备得到有序介孔M41S系列[17]，包括MCM-41(六方状)、MCM-48(立方状)、MCM-36(层柱状)、MCM-22(片状)[18]等；应用溶胶-凝胶法可以合成HMS介孔材料系列[19]。

2.2.3 智能型酶固定化载体

研究发现，相比较传统固定化酶方式，智能型载体具有独特的优势，优点是酶的负载量增加，酶的稳定性和活力均提高，底物和产物抑制降低，酶回收操作被简化[20]。目前常用的智能型酶固定化载体有温度敏感型、pH敏感型、离子敏感型、极性敏感型、光敏型、磁响应型、多重因素敏感型[21]等。由于目前大多数研究还停留在一些传统材料的研发上，智能型酶固定化载体进行酶固定化受到了一些限制[22]。

3 酶的固定化方法

酶的固定化方法非常多，针对不同的载体，可以采用不同的方法，对酶进行固定。有时候在研究中需要综合使用多种方法来进行固定。

3.1 化学固定化方法

化学固定化方法主要为共价键结合法。共价键结合法常通过醚、硫醚、酰胺或氨基甲酸酯键形成共价键，酶可以被不可逆固定化[23]。参与结合的官能团常常有由半胱氨酸、赖氨酸和天冬氨酸及谷氨酸的侧链。该方法的影响因素较多，可以受到载体的亲水性和稳定性、离子强度、pH和温度等因素的影响，每一个因素的变化都可能导致固定化酶的性质发生变化[24]。此方法的优点是结合牢固，缺点是成本比较高。目前，共价键结合法研究较为深入且应用相对较广泛。

交联法是采用双功能或多功能交联试剂，通过在酶分子和交联试剂之间形成共价键从而固定酶法。一般以几丁聚糖、壳聚糖等为载体，使用戊二醛、乙二醛、乙二胺、鞣酸、顺丁烯二酸酐及双偶氮苯等多功能试剂作为交联剂，可以将半乳糖苷酶、胃蛋白酶、脲酶等多种酶进行固定[25]。此方法的优点是：适用范围很广，既适用于固定化酶，又适用于固定化菌体。缺点是交联反应比较强烈，固定化后的酶的活性回收率通常较低。如果降低交联剂的浓度、缩短反应时间，可以提高酶活性的回收利用率，但因交联剂的价格昂贵，因此单独使用这种方法较少，通常采用两种或多种固定法，将交联法作为辅助方法。

3.2 物理固定化方法

物理吸附法是一种常用的物理固定化方法，原理主要是利用固体吸附剂把需要固定的酶吸附到其表面上从而实现固定化。吸附剂可以是活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷等有强吸附能力的不溶于水溶液的吸附材料[26]。还有人利用离子吸附法来固定酶，主要是应用具有离子交换基团的不溶性物质来吸附，通常使用阳离子和阴离子交换剂。此方法的优点是工艺非常简单，操作条件比较温和，从而酶的催化活力下降少，酶的构象基本或很少发生变化[27]；此方法可以采用的载体多、价格比较便宜；固定好的酶分子水平高，不容易发生断裂，酶分子回收利用率高；载体也可以回收再利用。

包埋法是指将酶包埋在高聚物的凝胶型或微胶囊型的包埋剂里的固定化方法。包埋法是酶固定化研究中最为普遍的一种物理方法[28]。此方法可以将酶固定在包埋材料内，这种包埋材料能够让小分子底物以及代谢产物自由通过，底物在包埋材料里与酶接触并反应[29]。包埋材料通常有海藻酸钠(SA)、聚乙烯醇(PVA)、骤丙烯酰胺(PAM)、琼脂等。该方法的优点是操作简单，固定酶的时候酶未发生化学和物理变化[30]，对酶的高级结构改变较少，酶回收利用率高。因为此方法把酶固定在包埋剂中而形成固定化小球，所以固定化小球结构较稳定，强度大，不易渗漏，不易受外界因素影响[31]。

物理固定化方法还可以采用热处理法，可以进行菌体固定。菌体是酶的供体，同时也是酶的载体。因为酶在高温下容易变性失活，所以并不适合所有的酶，只能用于那些热稳定好的酶，并且还要严格控制处理温度和加热的时间。此方法可以和其它方法综合使用。

4 结 语

由于酶作为生物催化剂具有价格昂贵、寿命有限等缺点，而酶固定化技术可以使酶重复使用，增加酶稳定性等，因此在生物医学、食品行业、环境工程中具有广泛的应用前景。

目前，各种载体固定化酶都各自有优缺点，因此发展方向应为：开发更多更实用的载体，或者进行多种载体复合以消除单一载体的弊端；随着大数据和互联网+的到来，建立酶固定化技术的数据库也是十分必要的；还可以采用计算机推测合理的载体结构，然后再进行实验。