畸胎瘤衍生生长因子-1与肿瘤关系研究进展

刘妍 徐勇

天津市泌尿外科研究所中心实验室，天津医科大学第二医院泌尿外科 300211

0 引 言

畸胎瘤衍生生长因子-1（cripto-1，CR-1）是表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）-CFC（CR-1/FRL-1/Crypic）家族的成员，它能在胚胎发育和细胞分化中起到重要的调节作用。CR-1主要在胚胎发育早期阶段表达并且其表达水平随发育逐渐降低；然而在细胞转化或者肿瘤发生时会出现过表达。研究结果证实，CR-1在前列腺癌、肺癌、乳腺癌和胰腺癌等多种肿瘤组织中呈高表达并且促进肿瘤发生发展的上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）过程[1]。近年来，CR-1被认为是新的肿瘤标志物[2]，可为肿瘤患者的诊断、治疗及预后评估提供新思路[3-4]。

1 CR-1与肿瘤的关系

1.1 CR-1的结构与生物学特性

CR-1即畸胎瘤衍生生长因子-1（teratocarcinomaderived growth factor-1,TDGF-1）[5]，首次在人和小鼠畸胎瘤中被发现并通过其cDNA文库分离出来。它存在于人染色体3p21.3，编码由188个氨基酸组成的相对分子质量为36×103的糖蛋白。CR-1蛋白是自分泌型肿瘤生长因子，cDNA为2.2 kb，由5个内含子和6个外显子组成，外显子上含有保守的EGF样结构域。CR-1蛋白主要由3部分组成：氨基末端（-NH2）的信号肽、经修饰的EGF结构域、富含半胱氨酸的CFC结构域及羧基（-COOH）疏水末端[6]，其中EGF和CFC是其两个特征性结构域。EGF样结构域与EGF蛋白功能区域相似，是转化生长因子-β（TGF-β）、Wnt/β-catenin 和 Notch 等受体的重要组成部分。CR-1蛋白同时也是糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol,GPI）连接的糖蛋白，通过羧基疏水末端结构，CR-1蛋白以GPI锚定的方式连接在细胞膜表面，可接受多种信号刺激，通过EGF样结构域的改变促进肿瘤细胞EGF受体异常高表达，促进恶性肿瘤细胞侵袭、转移及肿瘤血管的形成，其与肿瘤发生发展密切相关[7-8]。

1.2 CR-1在肿瘤中的作用机制

1.2.1 CR-1在肿瘤发生中的作用

CR-1是癌基因,在正常组织中不表达或呈低表达，但在肿瘤细胞中呈现高表达，提示肿瘤发生时CR-1高表达。Strizzi等[6]在对乳腺癌和结肠癌的研究中发现，癌组织中CR-1的表达明显高于正常组织，肿瘤发生高危人群中也被发现CR-1高表达[9-10]。Klauzinska等[11]研究结果也表明，CR-1既可以作为受体，也可作为一种自由配体，可介导肿瘤细胞的生长和侵袭并诱导EMT的发生。最新研究结果发现，CR-1在胶质母细胞瘤中具有很高的潜在作用[12]。过表达的CR-1在重塑分化肿瘤细胞成为肿瘤干细胞的过程中发挥重要作用。研究结果均提示，CR-1和肿瘤的发生密切相关，也为CR-1促进肿瘤发生机理提供了有力证据。

1.2.2 CR-1在肿瘤侵袭与转移中的作用

研究结果表明，构建小干扰RNA（siRNA）能够下调前列腺癌细胞中CR-1的表达[13]。采用Transwell方法观察干扰CR-1的癌细胞迁移和侵袭能力的情况。其研究结果表明，CR-1的沉默可显著抑制前列腺癌细胞的迁移和侵袭，同时还抑制基质金属蛋白酶；E-钙黏蛋白（E-cadherin）的表达水平增加，影响EMT的发生，提示CR-1可作为前列腺癌有效的治疗靶点。此外，有研究者在对神经胶质瘤细胞的研究中也得到了相同的结论[14]。许多研究结果也证实，CR-1可通过参与TGF-β信号通路、Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）信号通路和GSK-3β-E-cadherin等信号通路以增强肿瘤细胞的侵袭能力[15-16]。

1.2.3 CR-1在肿瘤血管形成中的作用

大量研究表明，CR-1在促进肿瘤血管形成中起着重要作用。Francescangeli等[17]在对结肠癌异种移植裸鼠模型的研究中发现,高表达CR-1的裸鼠能动态调节肿瘤干细胞的增殖能力且促进肿瘤周围血管的生成。也有研究结果表明，人乳腺癌细胞系中过表达的CR-1可促进细胞增殖、侵袭和血管样结构的形成；高表达CR-1的乳腺癌MCF-7细胞进行体外成瘤实验时,被发现裸鼠体内CD31细胞因子高表达,从而增强了癌细胞的血管生成能力[5]。由此可见，CR-1的表达与肿瘤血管形成密切相关。

1.2.4 CR-1在肿瘤预后评估中的作用

Wang等[18]研究结果发现，CR-1是肝癌患者总体生存时间（total lifetime,OS）和复发时间（time to recurrence，TTR）的独立预后因素。高表达的CR-1也与肝癌患者TNM分期以及BCLC分期密切相关。CR-1过表达可导致肝癌细胞侵袭性增强以及预后不良。研究结果还证实，CR-1/AFP高表达可能是影响肝癌患者生存的潜在预后标志物。Liu等[2]研究也证实，高表达CR-1的食管鳞状细胞癌患者OS明显降低,但高表达E-cadherin的患者OS显著升高。因此，研究者认为可通过两项指标的联合检测对食管鳞状细胞癌患者预后进行整体评估。总之，CR-1有可能是判断肿瘤预后新的标志物。

1.2.5 CR-1在肿瘤信号传导通路中的作用

CR-1在肿瘤细胞信号传导通路中发挥重要作用。CR-1通过肿瘤细胞信号传导通路促进癌细胞增殖和侵袭转移，结果促进了EMT发生。CR-1在EMT发生过程中主要通过蛋白降解和基因突变导致E-cadherin降低，参与肿瘤发生的许多生长因子均可诱导E-cadherin转录抑制剂的表达。在EMT进程中,CR-1与细胞内各种信号转导通路中细胞因子协同发挥重要作用，主要包括Wnt/β-catenin、TGF-β/Smad、Glypican/Src/Akt、Notch 信号通路等[19]。

（一）Nodal信号通路

有研究者在小鼠肉瘤病毒转化实验中证实肉瘤生长因子（sarcoma growth factor,SGF）的存在。由于它具有转化细胞的特性，又被称为转化生长因子（transforming growth factor,TGF）。TGF家族的一个重要亚群是TGF-β，它在调节早期胚胎发育和肿瘤EMT进程中起着重要作用[20]。CR-1作为TGF-β家族成员Nodal，GDFS1和3的受体促进Ⅰ型Alk4/Alk7丝氨酸-苏氨酸激酶膜受体和激活素Ⅱ受体复合物，可促进磷酸化和Smad-2/Smad-3基因的表达，最终导致EMT的发生[15]。

（二）非Nodal信号通路

除Nodal信号通路外，CR-1还可作为磷脂酰肌醇聚糖（Glypican-1）的配体激活MAPK/PI3K/AKT信号通路，从而促进肿瘤细胞的增殖及转移。Francescangeli等[17]在动态研究结肠癌时证实，CR-1与Glypican-1结合后，通过对Glypican/Src/Akt信号通路的调节，促进肿瘤细胞EMT发生。这些证据提示，在肿瘤细胞中通过Glypican/Src/Akt信号通路干扰CR-1的表达，能够抑制肿瘤细胞生长并且抑制晚期致癌的作用。CR-1将可能成为一种新型的、动态调控结肠癌细胞功能的靶蛋白。同时，Das等[21]研究HeLa细胞时也发现，Glypican-1蛋白表达降低时，CR-1并不能促进Hela细胞增殖。此外，他们还发现重组CR-1可增加HeLa细胞中的PTEN的表达，通过MAPK/PI3K/AKT信号通路的调节，最终抑制Hela细胞生长。

（三）Wnt/β-catenin及Notch信号通路

Wnt/β-catenin 信号 通路由 Wnt、frizzled、Dsh、APC复合体（APC，GSK3β 和Axin蛋白）、β-catenin、Tcf/Lef组成[22]。CR-1除了能促进磷酸化的Smad-2活化Wnt/β-catenin信号通路外，还可结合Wnt受体脂蛋白受体相关蛋白（LRP）5和6,促进其与Wnt3a的结合；Wnt3a能够增强β-catenin在细胞质中的稳定性，提高β-catenin/Tcf的转录活性，从而激活下游基因过表达,诱导乳腺癌、胃癌、肝癌[15，23-24]等肿瘤EMT的发生。Xu等[8]发现通过Wnt/β-catenin信号通路，肺癌患者血清CR-1水平异常增高。前列腺癌中CR-1和EMT之间的相关性也被发现[25]。Wu等[13]研究结果发现,过表达的CR-1在前列腺癌患者体内通过Wnt/β-catenin信号通路，可导致E-cadherin低表达。CR-1和E-cadherin有望成为新的有价值的诊断和监测前列腺癌患者的标志物。Lo等[16]也研究证实在肝癌细胞中，高表达的CR-1将促进E-cadherin显著降低，最终诱导EMT的发生。综上所述，高表达的CR-1可通过Wnt/β-catenin信号通路上调GSK-3β促进EMT的发生，而抑制E-cadherin的表达。这些研究均证实CR-1蛋白与Wnt/β-catenin信号通路密切相关。此外，Rangel等[26]通过对乳腺癌的研究结果提示,CR-1还可通过Wnt/β-catenin信号通路对Notch受体进行调节，增强Notch1前体的分裂过程，导致Notch信号通路被激活，最终促进Nodal过表达，同样也可导致EMT的发生。

1.3 CR-1与肿瘤的关系

1.3.1 CR-1与肺癌

Park等[10]应用组织芯片技术检测肺癌患者CR-1的表达情况。通过对265名肺癌患者的检测，有250名患者CR-1过表达。过表达CR-1的肺癌患者与低表达患者相比预后不良。因此，CR-1既可作为临床肺癌患者早期筛选高危患者辅助化疗的临床标志物，又可作为肺癌患者预后评估的标志物。Xu等[9]研究结果发现，肺癌患者血清CR-1水平高于对照组和良性肺病患者，根据血清CR-1水平诊断为肺癌的敏感性是56.8%。约37.5%的癌胚抗原阴性肺癌患者CR-1的阳性率为95%。I/II期肺癌患者联合使用CR-1和癌胚抗原这两种标记物进行检测，与单独进行癌胚抗原检测相比，可增加21%的敏感性和95%的特异性。单因素分析显示，CR-1阳性肺癌患者与阴性患者相比，其OS和无进展生存期（progression free survival,PFS）显著缩短。多因素分析研究显示，CR-1是PFS和OS的独立预后因子。Kaplan-Meier生存曲线进一步证实阴性CR-1患者具有较长的PFS和OS。因此可证实血清中CR-1水平检测是一种有效的诊断和预后评估肺癌的标记物。

1.3.2 CR-1与胃癌

Zhang等[27]研究发现，淋巴结转移的胃癌患者组织中CR-1表达阳性率明显高于无淋巴结转移的患者。CR-1表达水平也与胃癌的组织学分型以及劳伦分型相关。高表达CR-1有可能在胃癌发生和淋巴结转移中发挥重要作用。Zhong等[28]研究显示，胃癌患者组织中CR-1阳性或E-cadherin阴性与淋巴结转移、肝转移及TNM晚期相关。CR-1阴性或E-cadherin阳性的胃癌患者，5年生存率高于CR-1阳性或E-cadherin阴性患者。研究者应用CR-1和E-cadherin同时对胃癌患者进行预后评估时发现，CR-1阳性和E-cadherin阴性胃癌患者的预后与淋巴结转移、肝转移及TNM晚期均密切相关,同时患者的存活率也最低。多变量分析显示,CR-1阳性和E-cadherin阴性是胃癌独立的预后因素。因此CR-1联合E-cadherin检测对胃癌患者转移风险预测及预后评估具有重要价值。

1.3.3 CR-1与乳腺癌

Castro等[29]利用动物模型研究发现，预后不良的乳腺癌亚型三阴性乳腺癌（triple negative breast Cancer,TNBC）中，CR-1作为肿瘤胚胎干细胞标记物，存在于肿瘤组织的纺锤体区域并且在其启动子区域表现出活性，但在敲除CR-1基因后，能抑制乳腺癌肿瘤的生长和肺转移的发生。因此，CR-1将可作为一个靶点为TNBC患者提供基因替代治疗的策略。也有研究结果表明，乳腺癌MCF-7细胞中加入过表达的CR-1质粒，与加入空质粒的癌细胞相比，MCF-7细胞增殖、侵袭和迁移能力显著增加[30]。研究者还发现过表达CR-1的MCF-7细胞通过激活Akt和Smad-2信号传导通路，可促进乳腺癌细胞形成更加具有侵袭性的表型。

1.3.4 CR-1与前列腺癌

Liu等[25]研究发现，前列腺癌组织中CR-1的表达水平比前列腺增生组织高，其还可促进肿瘤细胞EMT的发生，结果导致β-catenin水平升高以及E-cadherin水平降低。前列腺癌患者组织中过表达的CR-1与血清中前列腺特异抗原（prostate specific antigen,PSA）水平、Gleason评分、临床分期与淋巴结转移密切相关。研究者进一步实验证实，携带CR-1干扰质粒的前列腺癌PC-3细胞侵袭及迁移能力均显著降低。因此，CR-1可作为一个新的肿瘤标志物，有助于前列腺癌患者临床个体化治疗的开展。

1.3.5 CR-1与其他肿瘤

研究人员在正常组织与食管癌，膀胱癌，肝癌、肺癌[2,4,9,18]等肿瘤组织中发现，肿瘤组织中CR-1的表达水平明显高于正常组织,证明CR-1在许多肿瘤的发生、发展以及侵袭转移中发挥重要作用。

1.4 CR-1在肿瘤诊断、治疗和预后评估中的价值

1.4.1 CR-1在肿瘤诊断及预后评估中的价值

Xu等[9]通过对健康人和非小细胞肺癌患者血清CR-1的检测发现，非小细胞肺癌患者血清CR-1水平显著提高，并且与患者TNM分期、淋巴结转移及远处转移有关。研究者以1.67 ng/mL的血浆浓度作为诊断阈值，对非小细胞肺癌有较好的诊断价值，提示血清CR-1检测将可用于非小细胞肺癌的早期检测手段。Kaplan-Meier分析结果显示，与高血清CR-1患者相比，低血清CR-1患者OS和PFS更好。单因素和多因素Cox回归分析表明，血清CR-1水平是影响非小细胞肺癌患者预后的独立危险因素。同样，Li等[31]研究证实，高表达CR-1的肝癌患者经导管动脉化疗栓塞术（transarterial chemoembolization,TACE）治疗后可获得较理想的总生存时间。因此，CR-1有可能是预测肝癌患者接受TACE治疗的潜在预后因素，结合CR-1和肿瘤的特征有助于肿瘤患者预后进行评估。研究人员还发现高表达CR-1的食管癌、肺癌、膀胱癌及肝癌患者预后较低表达CR-1 的患者差[2，4，9，18]。因此证明高表达的 CR-1 参与肿瘤的发生、发展，将会成为许多肿瘤有效的预后标志物。

1.4.2 CR-1在肿瘤治疗过程中的价值

根据CR-1的分子结构可制备针对不同区域的两种单克隆抗体（单抗）用于肿瘤患者的治疗。一种是抗CFC区域的单抗，可阻断Nodal和CR-1蛋白的结合；另一种是抗EGF区域的单抗，可阻断Nodal和ALK4之间的作用，从而抑制肿瘤细胞的生成。这些单抗都是作用于肿瘤组织的特异区域，不会与正常组织发生反应，更不会损伤正常组织及细胞[32]。

大量研究表明，利用RNA干扰技术也可抑制CR-1基因的表达。携带干扰质粒CR-1的肿瘤细胞增殖能力也能显著降低。Liu等[2]转染携带干扰质粒CR-1的食管鳞状细胞癌细胞后发现，转染组CR-1、干细胞以及EMT相关的基因表达水平明显降低，肿瘤细胞的自我更新、成瘤以及转移侵袭能力也同时下降。食管鳞状细胞癌患者组织中CR-1的表达水平与肿瘤临床TNM分期、侵袭性以及淋巴结转移密切相关。因此，CR-1能够成为一个肿瘤患者独立的预后因素以及潜在治疗的新靶点。Normanno等[33]研究也发现，抗CR-1的反义寡核苷酸治疗能显著抑制结肠癌、卵巢癌、肺癌和乳腺癌细胞的生长。抗转化生长因子（TGF-alpha）和抗双调节素（AR）反义寡核苷酸的实验也得到类似的结论。用CR-1反义寡核苷酸治疗肿瘤细胞，可显著降低CR-1 mRNA和蛋白的表达水平。这些数据均表明CR-1有望成为不同类型肿瘤干预性治疗的新靶点。

Zhang等[34]还发现，高表达CR-1的肿瘤患者对阿糖胞苷、顺氯氨铂，紫杉酚等化疗药物的敏感性显著降低。研究结果表明，高表达的CR-1可促进NF-κB-TAK-1信号通路的调节，最终激活Survivin基因，从而增加肿瘤细胞凋亡的耐受性。

2 结语

综上所述，CR-1是一个潜在的靶基因，与肿瘤的关系密切，其机制可能与 Nodal、Wnt/β-catenin 以及Notch信号通路有关，在肿瘤细胞侵袭和转移、肿瘤血管生成以及EMT过程中发挥重要作用；但是肿瘤的发生发展是一个多因素、多步骤的复杂过程。CR-1参与肿瘤发生发展进程的分子机制目前尚不十分清楚。因此，随着对CR-1和肿瘤关系研究的不断深入，CR-1将有利于肿瘤个体化治疗和预后风险的评估。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突