基于网络药理学预测银杏叶治疗心肌缺血的作用机制

谢 巍 杨 妮 肖 萍

柳州市妇幼保健院 (柳州 545001)

心肌缺血(Myocardial Ischemia)是指心脏血液灌注减少、供氧降低，导致能量代谢异常，无法支持心脏正常工作的一种病理状态[1]。血压降低、冠状动脉阻塞、炎症、心瓣膜病、血黏度变化、心肌病变均会引发心机缺血。西医临床上对心肌缺血的治疗重在改善供血、降低耗氧、提高心肌组织对低氧的耐受性[2- 3]。目前, 我们国家心脑血管疾病的发病率、病死率与日俱增, 心肌缺血已经演变成人类健康的头号杀手。中医将该病归属于“胸痹”范畴[4]。其主要病机为心脉痹阻，具有扩张血管类中药常用于心肌缺血的治疗。因此，探讨银杏叶治疗心肌缺血作用机制具有一定的应用价值。

银杏叶，为银杏科植物银杏GinkgobilobaL.的干燥叶，味甘、苦、涩，平，归心、肺经，具有敛肺，平喘，活血化瘀，止痛的功效，主要用于用于肺虚咳喘；冠心病，心绞痛，高血脂等疾病。其主要的化学成分银杏叶主要有黄酮、萜内酯、酚酸, 聚异戊烯醇等。其中黄酮、萜内酯和聚异戊烯醇是银杏叶发挥独特药理活性的有效成分[5- 6]。现代药理研究表明，银杏叶具有扩血管作用、抗凝、清除体内自由基、抗心肌缺血、再灌注损伤的作用[7]，银杏叶可能通过产生自由基产生延缓心肌功能及代谢的恢复、触发许多突发的代谢、电生理、形态学及功能性的改变治疗心肌缺血[8- 9]。但是，中药发挥疗效具有多成分、多靶点的特点，因此银杏叶抗心肌缺血机制是多途径的，目前对银杏叶发挥抗心肌缺血的药效成分及作用机制尚缺乏整体认识。

网络药理学是基于系统生物学和多向药理学的方法，通过构建生物分子网络从相互联系的角度研究问题，结合整体层面及分子网络层面为研究中药治疗疾病的分子机制提供了全面有效的方法[10-11]。将疾病的治疗策略从单靶点、单药转变为多靶点、多组分，与中药治疗疾病“整体性、多靶点”的特点契合。本文基于网络药理学方法构建银杏叶“成分-靶点-通路”网络，分析其治疗心肌缺血疾病的作用机制，寻找关键作用分子和信号通路，为进一步实验研究奠定基础。

1 资料与方法

1.1 银杏叶活性成分及其作用靶点的筛选

利用TCMSP数据库(http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)检索银杏叶中的化学成分，再筛选口服生物利用度(oral bioavailability)OB≥30%和类药性指数(drug like index)DL ≥ 0.18[12]的有效成分。进一步利用该平台查询化合物对应靶点，并将已筛选出的靶蛋白名转换为swiss-port ID和靶点简称，进行标准化。

1.2 心肌缺血的相关疾病靶基因收集

利用GeneCards数据平台(https：//genecards.weizmann.ac.il/v3/)和OMIM数据平台https：//www.omim.org/)，检索“心肌缺血”的相关靶基因，Uniprot 标准化基因信息，并剔除无人类样本Uniprot ID的基因。

1.3 基因映射

将化合物靶点和疾病靶点信息进行基因映射，获取化合物-疾病共同作用靶基因，并用R软件绘制Venn图，确定共同作用的靶基因。

1.4 PPI网络的构建

将银杏叶—心肌缺血共同作用靶点的基因上传至在线STRING平台(https：//string db.org/) 构建蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络模型，蛋白种属设置为“Homo sapiens”，最低相互作用阈值设为中等“medium confidence”(>0.4)，其他参数保持默认设置，获得PPI网络。

1.5 网络构建及分析

用Cytoscape 软件(v3.6.0) 构建“化合物—靶点—通路—疾病”网络图，并计算网络拓扑参数，将前20 位的信号通路与富集在该通路中的蛋白构建“靶点-通路”可视化网络。网络中一个节点的度表示与该节点直接相互作用的节点的数目，度值越大则表示该节点参与的生物功能越多，在网络中的重要性越大。

1.6 GO 功能富集分析及 KEGG通路富集分析

应用R软件的colorspace、stringi、DOSE、clusterProfiler、pathview等安装包进行GO 功能富集分析及 KEGG通路富集分析，对所预测的化学成分靶点进行富集分析，保留P≤0.05的结果，然后进行可视化处理，分析银杏叶治疗心肌缺血可能的生物过程和信号通路，最终分别绘制GO和KEGG富集分析的气泡图和通路图。

2 结 果

2.1 银杏叶潜在药效成分与靶点筛选

通过 TCMSP 共收集到银杏叶活性化合物307个，以 OB≥30%和 DL≥0.18 筛选高活性化合物27个，收集化合物的作用靶点2 164个。以自由度(Degree) 值表示预测出该成分与作用靶点的关联个数，度值的大小即代表着在网络中的关键度。见表1。共筛选525个作用靶点，见表1，分子MOL000098(槲皮素，quercetin) 的作用靶点最多(degree=145), 接着是分子MOL000422(山柰酚，kaempferol)(degree =63)，和分子MOL000006(毛地黄黄酮，luteolin)(degree=57) 等。这些活性成分具有较多的作用靶点，可能在银杏叶的药理功能中起到较为核心的作用。在27个活性成分中有15个成分有10以上的靶点，说明银杏叶中含有的这些活性成分可能共同作用于整个生物网络系统，而非单一靶点，一定程度说明中药所具有的多成分、多靶点的复杂性。

表1 银杏叶筛选后得到的27个活性成分

2.2 “银杏叶—心肌缺血靶点”共同靶点的筛选

靶点是药物与机体大分子之间的结合位点也是在药物和疾病之间最重要的衔接环节。在现代药物的研究和开发中，寻找和筛选药物最准确的靶点对确定药物的治疗方向以及保证药物的疗效具有重要意义。本研究检索 GeneCards和OMIM数据库，共获得类心肌缺血相关的疾病靶点531个，将这531个疾病靶点与463个银杏叶化学成分的作用靶点，采用R软件VennDiagram安装包绘制韦恩图，两者取交集后获得疾病-类药活性成分共同靶点40，这些靶点在银杏叶治疗心肌缺血中有重要意义的靶点。结果见图1。

图1 心肌缺血靶点与银杏叶有效成分靶点韦恩

2.3 “活性成分—作用靶点——相关疾病”网络模型构建

运用Cytoscape 软件将获得的疾病-类药活性成分40个共同靶点与活性成分和疾病构建网络模型。见图2。银杏叶的17种药效成分协同作用于40个心机缺血靶点，与槲皮素(quercetin)对应的靶点最多，其次为山奈酚(kaempferol)，毛地黄黄酮(luteolin)，异鼠李亭(isorhamnetin)说明银杏叶中槲皮素、山奈酚、毛地黄黄酮和异鼠李亭可能在治疗心肌缺血过程中起到关键作用，同时复杂的网络模型体现了中药的作用是多成分、多靶点协同作用的结果。

长方形代表中药银杏叶，菱形代表黄其中有效成分，尖叫四边形代表靶基因，大椭圆形代表心肌缺血疾病图2 “活性成分-作用靶点-相关疾病”网络模型

2.4 “银杏叶—心肌缺血靶点”蛋白互作(PPI)网络分析

通过在线 STRING 平台，设置medium confidence 选择大于0.4, 隐藏游离的点，获得 PPI 网络。该网络包括 39个节点，248条连线，每一条连线表示有一种证据证明两个蛋白有互作关系，每一个节点表示一个蛋白，节点的颜色表示不同的连接证据，节点自由度的大小表示在网络中的重要性越强。在此基础上采用R软件筛选出30个关键节点，制作条形图，从图中可以看与IL6连线有31条， VEGFA连线有30条，自由度较高的节点依次为:IL6，VEGFA，CASP3，MAPK8，MYC，NOS3，PPARG，ESR1，FOS，ICAM1等，说明这些靶点之间存在较密切的蛋白互作关系，见图3、图4。

图3 共同靶点PPI网络

图4 PPI 网络关键蛋白节点条形图

2.5 GO 功能富集分析

应用R软件 colorspace、stringing、DOSE、clusterprofiler、pathviwew 安装包对银杏叶-心肌缺血的40个共同作用靶蛋白进行GO生物功能分析，根据P<0.05 确定对应的条目，共42功能富集，绘制排名前20位的GO 条目，见图5，图中颜色越红。半胱氨酸肽链内切酶活性(cysteine-type endopeptidase activity)，内肽酶活力(endopeptidase activity)，激活转录因子结合(activating transcription factor binding)，DNA结合转录激活剂活性，RNA聚合酶II特异性(DNA-binding transcription activator activity, RNA polymerase II-specific)颜色较红，表明这些功能富集较密集，表明银杏叶可通过调控这些功能发挥对类心肌缺血的治疗作用。见图5。

2.6 KEGG通路富集分析

应用R软件 colorspace、stringing、DOSE、clusterprofiler、pathviwew 安装包对银杏叶-心肌缺血的40个共同作用靶蛋白进行KEGG通路富集分析，根据保留P≤0.05的结果，共富集到42条通路，对绘制排名前20位的KEGG气泡图，同时对筛选到的核心通路加以注释。图中颜色与大小取决于关联基因Count值和P值，红色节点越大信号通路的显著性就越高，说明该条信号通路的重要性越高，X轴表示关联基因数与信号通路上总基因数的比值，Y轴表示通路名称。见图5，通路TNF信号通路(TNF signaling pathway)，糖尿病并发症的年龄愤怒信号(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)， 细胞凋亡(apoptosis)，PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)表明银杏叶主要通过调节这些通路来治疗心肌缺血，通路富集分析气泡图结果见图6。

图5 GO 功能富集分析条形图

图6 KEGG通路富集气泡

2.7 通路分析

肿瘤坏死因子信号通路(TNF signaling pathway)在KEGG通路富集分中富集程度较高，故对此通道进一步分析，通路图中红色标志表明通过影响该基因的表达影响该通路。见图6，银杏叶中有效成分通过影响组织蛋白酶(cathepsin)、半胱氨酸蛋白酶- 8(CASP8)、半胱氨酸蛋白酶- 3(CASP3)、半胱氨酸蛋白酶- 7(CASP7)、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)、核转录因子激活蛋白-1(AP-1)、氨基末端激酶1/2(JNK1/2)、氨基末端激酶(JNK)、IkBa 、转录因子FOS基因、白细胞介素(IL6)表达、细胞粘着(cell adhesion)、细胞间粘附分子(ICAM1)、血管细胞粘附分子(VCAm1)来影响卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染通路。见图7。

图7 卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染通路分析图

3 讨 论

心肌缺血是心脏供氧减少，心肌能量代谢不正常，导致的一种病理状态，现代医学认为，心肌缺血是由于血压降低、主动脉供血减少或者冠状动脉阻塞导致的心脏供血减少 。另外心瓣膜病、血黏度变化、心肌本身病变也会使心肌缺血。虽然目前有文献报道银杏叶治疗心肌缺血再灌注损伤，大多以大鼠和家兔实验，以银杏叶中整体成分为研究，未具体到具体的化学成分，且缺乏专门发病机制的治疗策略，其作用机制尚不明确，故基于网络药理学预测银杏叶单味中药在治疗心肌缺血的作用机制和关键通路有重要意义。

本研究基于网络药理学方法，收集银杏叶包含的27种高活性化合物，2 164个靶点，与心肌缺血531个疾病相关靶点进行基因映射，获得40个映射基因，构建了蛋白互作网络。银杏叶中槲皮素、山柰酚和毛地黄黄酮几个成分自由度较高，表明这几个成分在治疗心肌缺血方面占主要作用；PPI蛋白互作网络中IL6，VEGFA，CASP3，MAPK8，MYC，NOS3，PPARG几个靶点连线较多，表明主要通过影响这些靶点来治疗疾病；GO 功能富集分析显示银杏叶治疗心肌缺血的基因富集在半胱氨酸肽链内切酶活性、内肽酶活力、激活转录因子结合、DNA结合转录激活剂活性，RNA聚合酶II特异性等功能。KEGG 通路富集分析显示银杏叶通过影响TNF信号通路、糖尿病并发症的年龄愤怒信号、 细胞凋亡、PI3K-Akt信号通路等目的，进一步达到对心肌缺血疾病的治疗。

本研究所得的结果仍有局限的地方。通过数据挖掘对药物的功能和作用进行预测，未来还需要在基础和临床实验中进一步证实。另外口服利用度和类药性的筛选本身也存在着限制，药物在人体的吸收利用不仅仅局限于口服，目前银杏叶提取物的注射剂已经广泛在临床使用，在以后的新药预测和开发中还需要重视口服利用度较低的成分，可能有更广泛的潜在治疗作用。本文通过网络药理学的方法，探索银杏叶可能作用于心肌缺血的关键靶基因及信号通路，为中药研究提供新的思路与方法。