SMPD1基因与细胞外囊泡生物发生的研究进展

黄子慧?陈煜森?马晓瑭?许小冰?李婵娣

【摘要】由SMPD1基因编码的酸性鞘磷脂酶不仅介导溶酶体代谢、参与膜结构的调节和信号转导，且对鞘磷脂转化为神经酰胺起关键作用。细胞外囊泡是由细胞分泌或细胞膜上脱落的一种具有多功能的异质膜囊泡。研究显示，酸性鞘磷脂酶及其下游代谢物神经酰胺与细胞外囊泡的分泌释放相关。如今细胞外囊泡的生物发生越来越受到人们的关注，该文就SMPD1基因对细胞外囊泡生物发生的研究现状进行综述。

【关键词】SMPD1基因;酸性鞘磷脂酶;神经酰胺;细胞外囊泡

Research progress on SMPD1 gene and extracellular vesicle biogenesis Huang Zihui， Chen Yusen， Ma Xiaotang， Xu Xiaobing， Li Chandi. Department of Neurology， Affiliated Hospital of Guangdong Medical University， Zhanjiang 524000， China

Correspondent author， Chen Yusen， E-mail： chenyusen925@ 163. com

【Abstract】Acid sphingomyelinase encoded by SMPD1 gene not only mediates lysosomal metabolism， participates in membrane structure regulation and signal transduction， but also plays a key role in the conversion of sphingomyelin into ceramide. Extracellular vesicles are multifunctional vesicular vesicles that are secreted by cells or shed on the cell membrane. Studies have shown that acid sphingomyelinase and its downstream metabolite ceramide are associated with the secretion and release of extracellular vesicles. Nowadays， the bioecogenesis of extracellular vesicles has attracted more and more attention. This article reviews the research status of SMPD1 gene on extracellular vesicle biogenesis.

【Key words】SMPD1 gene;Acid sphingomyelinase;Ceramide;Extracellular vesicle

细胞外囊泡（EV）可包裹生物活性蛋白、糖类、脂质和广泛核酸，作为独特载体在体液中稳定存在，起细胞间通讯、生物标志物、治疗等作用[1]。越来越多研究表明EV在多种疾病的预防、诊断、治疗、预后评估中具有良好的应用前景。因此，明确EV生物发生的作用和分子机制对疾病的预防和治疗都有着重要意义。关于EV的命名和分类尚未统一，  一般认为其包括外泌体、微囊泡（也称为微粒）、外胚层、迁移体和凋亡小体。本文主要讨论2种被广泛研究的EV，即外泌体和微囊泡。SMPD1基因介导编码的酸性鞘磷脂酶（ASMase）及其下游代谢物神经酰胺可通过改变脂质成分使细胞膜特性剧烈变化而触发信号传导事件并改变膜曲率，参与EV的分泌与释放。研究SMPD1基因编码的ASMase有望通过调控EV生物发生为疾病寻找到新的治疗靶点。

一、SMPD1基因概述

1. SMPD1基因及其所编码的蛋白

SMPD1基因的细胞遗传学位置在11号染色体的短臂（11p15.1 ～ 11p15.4），其模板DNA全长约 2.5 kb，包括 1890 bp 的開放阅读框，编码 629 个氨基酸。其编码酶的6个N-糖基化位点中有5个被占据，寡糖侧链含有甘露糖-6-磷酸残基，这是溶酶体蛋白的典型特征。此外对ASMase二硫键结构的研究显示，氨基酸残基629处的末端半胱氨酸是唯一不参与分子内二硫键的半胱氨酸。事实上，这一末端半胱氨酸残基必须去除才能获得完整的ASMase活性，因此该残基在成熟蛋白质中的保留可能会导致出现不具活性、分子量较高的聚集物[2]。

2. ASMase

SMPD1基因编码的ASMase属于鞘磷脂酶家族，可在多种细胞内表达。ASMase在细胞信号传导中的作用与其重组质膜的能力紧密相关。ASMase对鞘磷脂转化为神经酰胺起关键作用，前者在一定外源刺激下能快速被活化并释放到细胞表面，水解细胞膜上鞘磷脂，使神经酰胺水平在数秒至数分钟内迅速上升。富含神经酰胺的结构域进一步融合，于细胞质膜外小叶上形成神经酰胺大平台，以增强蛋白质密度，并通过改变膜物理性质或直接的神经酰胺-蛋白质相互作用，促进受体二聚化以及其他蛋白质-蛋白质相互作用。目前认为，ASMase有助于重组细胞表面并激活微域内的信号蛋白，从而增强或降低下游信号的阈值。另神经酰胺可进一步转化为鞘氨醇-1-磷酸（S1P）、鞘氨醇等一系列生物活性脂质，通过脂质成分的改变促进细胞膜特性剧烈变化而触发信号传导事件[3]。神经酰胺和S1P作为信号分子中的主要鞘脂控制许多细胞活动，包括血管生成、炎症、细胞增殖、凋亡、衰老、自噬、转移等。ASMase不仅介导了溶酶体代谢、参与膜结构的调节和信号转导，还参与免疫调节、炎症、细菌感染、凋亡、肿瘤调控、脱髓鞘等过程[4-7]。可见，SMPD1基因编码的ASMase对细胞和组织的正常结构及功能至关重要。

3. SMPD1基因与疾病

SMPD1基因缺失会引起尼曼-皮克病（NPD），NPD是一种罕见的常染色体隐性遗传病，属于溶酶体贮积症[8]。ASMase缺乏可表现出A型或B型NPD。A型NPD患儿通常伴随着神经系统症状，并在出生6个月内逐渐出现肝脾肿大、生长受限和明显的肺部感染等。B型NPD患者很少或不出现神经变性，其最常见的临床表现是肝脾增大，一般能存活到成年，发病年龄可从幼儿期到成年期。

除NPD外，ASMase活性的改变还与多种神经系统疾病息息相关。研究者在病例对照分析研究中发现，SMPD1基因中的Leu-Ala（Val）重复变异增加了中国汉族人群帕金森病的患病风险[9]。SMPD1基因敲除或敲减可使HeLa细胞中α-突触核蛋白水平增加，而帕金森病患者中SMPD1突变，ASMase水平降低，使帕金森病发生提早3.5 ～ 5.8年[10]。在阿尔兹海默病（AD）中，AD患者和AD小鼠的成纤维细胞、脑或血浆中ASMase增加，导致自噬空泡数量增加，从而引起自噬降解缺陷。在AD小鼠模型中，抑制ASMase可减少β淀粉样蛋白沉积并挽救受损记忆[11]。在创伤性脑损伤中，ASMase的转录后激活可导致损伤后第1周线粒体中鞘氨醇选择性增加，伴随线粒体细胞色素氧化酶活性降低和Nod样受体蛋白3炎症小体活化，使线粒体呼吸链紊乱及促进神经炎症。抑制ASMase还可以减轻创伤性脑损伤早期反应性星形胶质细胞病变[12]。研究表明，ASMase在老年人和老年小鼠的脑微血管内皮细胞和血浆中升高，其通过增加细胞膜穴样内陷介导的胞吞作用导致血脑屏障损伤和加速神经元功能障碍。ASMase的基因敲减和内皮特异性敲减可改善血脑屏障破坏和衰老期间的神经认知障碍[13]。

二、EV的生成与分泌机制

外泌体是先在多泡体内形成管腔内囊泡（ILV）然后与质膜融合而分泌形成的，代表粒径40 ～ 100 nm的囊泡群。外泌体在多泡体中形成ILV，需要招募转运必需内体分选复合物（ESCRT）到ILV形成部位[14]。在多泡体中产

生ILV的分子基础是ESCRT 0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ等4种蛋白组成的复合体和辅助蛋白ALIX（也称为PDCD6IP）。ESCRT 0识别内体膜外部的泛素化蛋白质。ESCRTⅠ将泛素化的内容物结合在内体膜上，激活ESCRTⅡ。ESCRT Ⅲ通过ALIX募集，并与ESCRT-Ⅰ复合物上的TSG101结合。ALIX与TSG101结合，起到连接ESCRT I和ESCRT Ⅲ的作用。随后，募集去泛素化酶，从内容物蛋白中去除泛素标签以完成分选过程。最后，ESCRT Ⅲ被AAA-ATPase SKD1分解并回收利用以进行另一轮内容物招募。总之，ESCRTⅠ和Ⅱ被认为是启动ILV萌芽的过程，而ESCRT Ⅲ则完成了这一过程。然而并非所有外泌体的形成都是依赖ESCRT途径的，一些细胞在ESCRT复合物敲除的情况下仍然能产生外泌体。

微囊泡是粒径大小为100 nm ～ 1 mm、由质膜衍生的比外泌体更大的异质囊泡群。其直接由质膜发芽起泡释放而成，并可能包含细胞骨架和内质网元件，涉及皮质肌动蛋白重组和随后的质膜向外突出和分离。钙离子依赖性酶机制包括氨基磷脂转位酶、拼接酶和钙蛋白酶驱动膜磷脂不对称重排，即磷脂酰丝氨酸从内小叶到细胞表面的暴露，导致膜的物理性弯曲和肌动蛋白细胞骨架重组，这有利于膜出芽和微囊泡形成[15]。

细胞如何分泌与释放EV尚处于初级研究阶段，有研究表明这些过程需要细胞骨架蛋白如微丝及微管蛋白、动力蛋白、小鸟苷三磷酸（GTP）酶以及融合可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感的融合蛋白附着蛋白（SNARE）和锚定蛋白的参与。亦有研究表明某些膜脂在调节EV分泌中起作用，如由二酰甘油激酶或磷脂酶D活性而产生的磷脂酸可影响外泌体分泌。

三、ASMase与EV

1. ASMase与EV

ASMase与病理条件下红细胞释放EV相关。据报道，镰状细胞病的质膜应激和改变，增强了ASMase的活性，导致红细胞产生的EV增加[16]。使用ASMase间接抑制剂阿米替林治疗可减少镰状细胞病的体外和体内模型中EV的产生，这提示了减轻病情的可能治疗方法。另一项研究表明，ASMase与内皮细胞中香烟烟雾诱发的EV释放有关[17]。暴露于香烟烟雾后，内皮细胞自身收缩并从缩回丝状伪足结构的尖端释放EV。使用ASMase抑制剂丙咪嗪可明显降低香烟烟雾诱导的EV产生，暴露于香烟烟雾后缺乏ASMase小鼠血浆中EV水平降低，而在内皮细胞过表达ASMase小鼠中循环EV水平增加，这些结果均证实了ASMase的激活在香烟烟雾诱导的EV释放中起关键作用。

2. ASMase与外泌体

有研究表明，神经酰胺合成参与多泡体腔内囊泡的形成不依赖ESCRT生物发生途径，多泡体与质膜融合后，囊泡以外泌体的形式释放。然而可使鞘脂酶水解成磷酸胆碱和神经酰胺的除了ASMases外，还包括了其他鞘磷脂酶，其中对外泌体生物发生研究较多的是中性鞘磷脂酶（NSMase）。在少突胶质细胞系（Oli-Neu）外泌体的分选机制研究中，用NSMase抑制剂处理Oli-Neu细胞后，外泌体释放明显减少。NSMase2的小干扰RNA耗尽也证实了酶参与包裹蛋白脂质蛋白（PLP）外泌体的形成和分泌。在此基础上，有学者提出PLP阳性外泌体的生物發生在富含鞘磷脂的膜结构域，它们通过形成神经酰胺微结构域进而聚结成更大的结构域，促进囊泡出芽。神经酰胺的锥形结构诱导内体膜的自发负曲率，有利于多泡体内部形成内囊泡。随后的研究显示，给予外源性神经酰胺可剂量依赖性地增加从多发性骨髓瘤细胞中释放的外泌体数量[18]。鞘磷脂合酶抑制剂D609抑制神经酰胺转化为鞘磷脂引起神经酰胺升高促进了外泌体分泌[19]。总而言之，神经酰胺对外泌体释放十分重要。

在人巨噬细胞系U937中，ASMase通过氧化LDL的免疫复合物对表面Fcγ受体的作用而激活，使含有IL-1β的外泌体释放[20]。ASMase与外泌体释放的研究目前报道较少。但既然ASMase也可作用于鞘磷脂生成神经酰胺，那么其对外泌体释放可能也具有重要调控作用，值得进一步研究。

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（收稿日期：2019-11-01）

（本文編辑：林燕薇）