生殖道微生物组学在胚胎移植中应用的研究进展

任姝晴，张崴

近年不孕症的发病率不断上升，中国女性不孕症发病率约为7.4%[1]。不孕症是生殖医学研究的热点问题之一，研究显示半数以上的不孕症患者最终会选择人工助孕[2-3]。然而胚胎移植（ET）成功率受多种因素影响，有研究表明，阴道微生物群异常可能会降低体外受精（IVF）患者的临床妊娠率[4]，是目前辅助生殖过程中关注的问题。通过生殖道微生物组学技术可为不孕症及反复助孕失败患者提供新的治疗思路和干预措施，进而改善因生殖道微生态改变而导致的胚胎着床率降低。本文对近年女性生殖道微生物组学与ET的相关研究加以综述，并展望生殖医学领域微生物组学未来的研究方向。

1 女性生殖道微生物组学研究

女性生殖道微生物种类较其他部位的微生物菌群组成相对简单，生殖道微生态与宿主、环境之间构成了相互制约、相互协调的动态平衡，在维护女性生殖健康中发挥重要作用。健康女性阴道分泌物中可分离出50多种微生物种类，包括乳酸杆菌、葡萄球菌、拟杆菌、棒状杆菌、肠球菌、链球菌、大肠杆菌、消化链球菌、加德纳菌和双歧杆菌以及原虫、病毒、支原体和白色假丝酵母菌等。乳酸杆菌作为正常女性阴道中的主要常驻菌，是维持阴道微生态平衡的核心。阴道内乳酸杆菌将鳞状上皮细胞内的糖原分解成乳酸，产生乳酸抑制其他致病菌的过度生长；还可分泌过氧化氢、细菌素、类细菌素等抑制致病微生物生长；同时采用替代、竞争排斥机制阻止致病微生物黏附于阴道上皮细胞[5]。乳酸杆菌通过刺激宿主吞噬细胞的吞噬能力、刺激细胞产生各种细胞因子如白细胞介素12（IL-12）、干扰素（IFN）、肿瘤坏死因子（TNF）、IL-10 等，增强宿主的免疫能力[6-7]。

研究证明女性生殖道微生物组会受到多种因素的影响，包括环境、行为、种族、基因等因素[8-9]。其中激素水平的变化是最重要影响因素，如月经期、青春期、妊娠期、绝经期微生物群落会发生明显的变化[10]。

有关女性阴道的定植菌属分类，2011年Ravel等[11]使用16SrRNA测序技术研究了396名不同种族北美女性的阴道菌群，发现可分为5种类型，其中集落类型（CST）Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ分别代表卷曲乳酸杆菌、加氏乳酸杆菌、惰性乳酸杆菌和詹氏乳酸杆菌，其占比分别为26.2%、6.3%、34.1%、5.3%，而CSTⅣ则是一个大的异质性菌群，包括CSTⅣ-A和CSTⅣ-B。构成CSTⅣ-A的菌属主要有：加德纳菌属、气球菌属、棒状杆菌属、达芬戈尔德菌、链球菌、奇异菌属、普氏菌属、微单胞菌属、纤毛菌属、动弯杆菌属和吲哚嗜胨菌。CSTⅣ-B的特征是变异菌属占主要优势菌，伴有其他的多样性菌属。卷曲乳酸杆菌的pH值中位数最低，为4.0±0.3。CSTⅣ菌群的pH值中位数最高，为5.3±0.6。未来应关注菌群分布的个体化，并将其作为疾病风险评估的一部分，为女性生殖健康提供帮助。有研究发现CSTⅠ组微生物群落的稳定性最高，CSTⅢ组易向CSTⅣ组转变，CSTⅢ、Ⅳ组菌群也易向其他组发生转变[12]。

除了女性阴道，研究表明在宫颈管、宫腔、输卵管及盆腔游离性液体中均提示有微生物群落的存在。2015年Mitchell等[13]在患者行子宫切除术前采集阴道分泌物，子宫切除后无菌切开子宫并采集子宫内膜和宫颈标本。对惰性乳酸杆菌、詹氏乳酸杆菌、卷曲乳酸杆菌、阴道加德纳菌、埃氏菌、普雷沃氏菌、纤毛菌等细菌进行了聚合酶链反应（PCR）检测和16SrRNA基因分析，结果发现58例患者中有55例患者的上生殖道至少有1种细菌阳性，但细菌量显著低于阴道，这表明宫颈作为连接阴道和宫腔的桥梁可能起着过滤器的作用，或与子宫内膜通过免疫反应清除细菌有关，或两者兼而有之。认为宫腔内并非无菌，但是宫腔内低水平细菌的存在与显著的炎症无关。

2017年，北京大学深圳医院与华大科学院的研究团队也做了相关研究，对我国育龄期正常女性的阴道下三分之一、后穹窿、宫颈、宫腔、输卵管、腹膜六个部位的定植微生物进行了大规模基因检测，结果显示，生殖系统定植菌群含量呈一个连续变化的过程。取自阴道不同部位及宫颈的样本都表现出低的物种多样性，乳酸杆菌占绝对主导地位，优势菌种为卷曲乳酸杆菌、惰性乳酸杆菌、加氏乳酸杆菌和詹氏乳酸杆菌，这与国外报道一致[11,14-15]。从阴道到宫颈，乳酸杆菌、普雷沃菌含量逐渐下降，假单胞菌、不动杆菌、漫游球菌和微生长单胞菌含量逐渐增加，乳酸杆菌所占比例由99.9%下降至97.56%。而输卵管定植菌群分布比例为：不动杆菌18.27%，丛毛单胞菌11.49%，假单胞菌9.9%，其他类假单胞菌9.1%，微生长单胞菌属5.11%，漫游球菌属4.84%[16]。

2 生殖道微生物组学在ET中的应用

目前ET的临床妊娠率仅有29.7%～43.4%[17]。ET成功率受年龄、子宫内膜容受性、生殖道感染、胚胎质量、移植技术限制等诸多因素影响。阴道及宫腔的感染显著降低移植胚胎的存活率。因此通过研究生殖道微生物对提高ET成功率具有重要意义。

2.1 生殖道优势菌改变对ET成功率影响 2012年Hyman等[18]对30例接受IVF-ET治疗患者在不同激素水平下对阴道微生物进行基因测序，研究表明，在治疗期间33%的女性阴道内发现了新的细菌。ET当日患者的阴道微生物组学异常影响妊娠率，乳酸杆菌含量与IVF患者的临床妊娠率呈正相关。且阴道以乳酸杆菌为优势菌的患者，IVF-ET术后妊娠率比以大肠杆菌、葡萄球菌等细菌为主的患者有较高的临床妊娠率。

2016年Moreno等[19]对同一受试者的阴道及子宫内膜菌群进行检测，发现不同的细菌群落分为以乳酸杆菌为主的微生物群（＞90%乳酸杆菌属）和非乳酸杆菌为主的微生物群（＜90%乳酸杆菌属，含有＞10%的其他细菌）。子宫内膜微生物群在子宫内膜获得容受性的过程中不受激素规律调控。但以非乳酸杆菌为主的微生物群与植入率（60.7%vs.23.1%，P=0.02）、妊娠率（70.6%vs.33.3%，P=0.03）、持续妊娠率（58.8%vs.13.3%，P=0.02）和活产率（58.8%vs.6.7%，P=0.002）显着降低有关。非乳酸杆菌主导的微生物群可能会触发子宫内膜炎症反应，其释放的炎症介质在调节胚泡与子宫内膜壁的黏附中起着重要作用，可被视为植入失败和妊娠失败的原因。

2016年Haahr[4]在一项前瞻性队列研究（n=130）中表明，细菌性阴道病（BV）和阴道菌群比例失调的育龄期女性，IVF术后临床妊娠率较正常阴道微生态女性降低（8%vs.40%，9%vs.35%，P＜0.05）。然而一项纳入12项研究的荟萃分析研究表明，BV可能会导致不孕症及流产，但对不孕症患者IVF术后妊娠率并无影响[20]。因此BV是否对IVF术后临床妊娠率有影响目前尚处于争议中。

2.2 阴道内不同乳杆菌属对ET结局的影响 研究发现不同乳杆菌属对胚胎移植后妊娠率也有影响。2018年Koedooder等[21]将阴道微生物组学作为IVF或IVF-胞浆内单精子注射（ICSI）治疗后能否妊娠的预测因子，发现在已知IVF或IVF-肥浆内单精子注射（ICSI）结果的192例女性中，有34例女性是“不利的微生物组谱”（指乳酸杆菌量＜20%，詹氏乳杆菌量＞35%，阴道加德纳菌IS-pro1型或变形菌量＞28%）。在鲜胚移植后，这34例女性中只有2例（5.9%）妊娠。当这种不利的微生物组谱用作妊娠失败的预测因子时，预测准确度为94%（敏感度为26%，特异度为97%）。而有利的微生物组谱中，相对丰度（≥60%）的卷曲乳杆菌的女性（63/192，33%）在移植后有24%的机会妊娠（15/63）。相比之下，乳酸杆菌相对丰度（≥60%）的女性（38/192，20%）在新鲜ET后有50%的机会妊娠（19/38）。高丰度的乳杆菌可能有利于IVF或IVFICSI结局，但高丰度（＞60%）的卷曲乳杆菌是不利的。该研究结果目前限制在IVF或IVF-ICSI人群中。然而是否可以扩展到非辅助生殖技术（ART）的一般人群仍无法确定。未来的研究有望阐明通过调节阴道微生物来改善IVF或IVF-ICSI患者的预后。

2.3 卵泡液中菌群对ET结局的影响 除了女性生殖道菌群可能影响胚胎移植成功率，卵泡液中菌群对其也有影响。2013年Pelzer等[22]研究了卵泡液中菌群改变对IVF妊娠的影响，发现如果在卵泡液中检出微生物，而在阴道内（卵母细胞取出时）未检出微生物，则将该卵泡液分类为“定植”；如果在卵泡液中也检出阴道中存在的微生物，则分类为“污染”。与卵泡液被微生物污染的女性相比，在卵泡液中定植微生物的女性妊娠率较低。但该研究并未阐述阴道菌群是如何影响卵泡液中菌群。其研究发现：①卵泡液不是无菌的，实际上包含不同含量的各种微生物；②卵泡液可被微生物定植或感染；③从卵泡液中分离出机会致病菌（包括丙酸杆菌属、链球菌属、金黄色葡萄球菌属和双歧杆菌属），并且与不良的IVF结果有关，包括胚胎移植率降低；④卵泡液内乳酸杆菌含量与IVF妊娠结局呈正相关；⑤左侧和右侧卵泡液中微生物菌群分布不同，且左卵泡液中培养出的微生物率更高，这可能与双侧卵巢不同的血液供应有关。因此IVF周期反复失败的女性可能会受益于阴道微生物筛查。

2.4 ET操作过程中存在感染对ET结局的影响 在IVF-ET移植操作中，也应注意存在感染可能。当移植管穿过宫颈到达宫腔时，宫颈的菌群及病原体会污染移植管并被带入到宫腔，进而影响妊娠结局[23]。2018年Wee等[24]也认为在取样过程中，应尽量避免移出子宫内膜及子宫颈标本时对阴道造成交叉感染，未来应更加关注子宫内膜菌群，可在ET前进行子宫内膜微生物群检测，或可通过选择子宫内膜基因表达以优化妊娠结局。Herath等[25]认为为了更好地了解IVF时宫颈、阴道菌群和导管污染对结果的影响，可采取特定的干预措施来减少促炎细胞因子反应并建立正常的阴道菌群，而这可能与子宫内膜的Toll样受体4的表达有关。

2.5 降低生殖道炎性反应对ET结局的影响 有研究表明使用抗生素降低生殖道炎性反应对ET结果也有积极影响。2015年Cicinelli等[26]对106例不明原因不孕女性的研究发现，66%患者子宫内膜活检表现为慢性子宫内膜炎。其中33%的子宫内膜炎患者内膜中可培养出粪肠球菌，30%的患者支原体阳性，23%的患者大肠杆菌阳性，使用合适的抗生素治疗后ET成功率和活产率均高于未治疗组。Sirota等[27]认为目前尚不清楚在IVF-ET周期中使用预防性抗生素是否对植入有影响。先前的研究建议预防性使用广谱抗生素，然而这样会降低在生殖道中占主导地位的产生H2O2的乳酸杆菌数量。未来的研究方向将是确定生殖道菌群中的微生物并针对其使用预防性抗生素，但不影响产生H2O2的乳酸杆菌。

3 生殖道微生物组影响ET成功率的可能机制

目前认为阴道菌群可上行定植于宫腔，因宫腔内环境特殊的生理条件，导致子宫内膜菌群与阴道内菌群有显著差异。子宫内膜微生态改变常见症状为慢性子宫内膜炎，多因阴道细菌上行感染导致炎症反应所致。正常妊娠子宫内膜容受期间，子宫内膜的定植菌群处于高度稳定状态，炎症状态下子宫内膜容受性明显降低。因此，宫腔感染及宫腔定植菌群改变可能引起异常炎症及免疫反应，破坏子宫内膜容受性，导致胚胎着床及发育受到影响。

3.1 宫腔菌群改变可能引起慢性子宫内膜炎症 慢性炎症影响子宫内膜腺体的分泌状况，可造成胚胎着床障碍，局部炎性细胞的浸润和炎症介质的渗出，引起细胞毒性作用，不利于精子成活和胚胎着床。趋化因子在种植窗期母-胎界面起着重要作用，慢性子宫内膜炎时，选择素E、趋化因子配体1（CXCL-1）、CXCL-13等分泌异常，这就表明病原微生物感染可能会触发异常的子宫内膜微环境，从而在慢性子宫内膜炎的B细胞选择性外渗中发挥作用[28]。但生殖道病原菌对子宫内膜局部炎症反应、免疫稳态的影响尚没有直接证据，目前还需要更多的研究进一步阐明其机制[29]。

3.2 宫腔微生态参与形成子宫内膜免疫共同体 宫腔微生物群在子宫内膜处于免疫平衡，下生殖道细菌上行感染可于宫腔定植，宿主免疫抑制细菌增殖和侵袭，这些机制牵涉宫颈黏液栓、子宫内膜上皮及其免疫细胞成分（中性粒细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞），以及先天免疫系统的成分（包括天然抗菌肽）。在妊娠状态下，子宫内膜中的定植菌群的稳定也提示子宫内膜免疫及宫腔细菌存在平衡状态[30]。

3.3 子宫内膜炎患者子宫内膜局部黏膜免疫与细胞免疫失调 Tortorella等[31]研究发现，子宫内膜容受性的降低与子宫内膜自然杀伤（NK）细胞含量下降有关，同时发现内膜基质中B细胞的募集现象，发现黏附分子和趋化因子的异常表达。子宫内膜炎患者的月经流出物显示促炎细胞因子水平升高，包括IL-6、IL-1β和TNF-α。

3.4 子宫内膜与局部免疫和胚胎植入的关系 种植窗期的子宫内膜提供了一个富含多种细胞因子的微环境，通过促炎反应和抗炎反应环境高度调节免疫细胞的招募和滋养层细胞的迁移及侵袭。在胚胎植入及胎盘血管形成阶段，良好的子宫内膜功能和形态以及稳定的免疫状态是影响胎盘及胚胎存活、继续妊娠的重要因素。

4 展望

随着人类微生物组计划及其他微生物宏基因组相关项目的开展，人们对生殖道微生物群落的认识不断深入。越来越多学者认为，人体微生物研究领域的成果有望为疾病发病机制的研究及诊疗技术带来突破性进展。近年国内外有关生殖道微生物学的研究不仅局限于阴道内，子宫内膜微生态、输卵管微生态、盆腔微生态均可能对育龄女性生育力造成影响[32]。目前生殖道微生物失调与疾病的因果关系尚未确立，仍需大量研究来证实具体菌群改变与特定生殖道疾病的关系及发生机制以及深入研究生殖道菌群特点与临床疾病的关系。因此，重视生殖道微生态，从另一维度加强维护了辅助生殖技术的安全，为不孕症患者获得良好助孕结局提供了新的思考方向。