骨 肉 瘤 免 疫 疗 法 的 研 究 进 展

黄 重 贾瑞鹏 钟海琳 符策岗

(1 中南大学湘雅医学院附属海口医院骨科中心，海南省海口市 570208，电子邮箱：840351452@qq.com；2 上海市第六人民医院暨海南省海口骨科与糖尿病医院骨科，海口市 570000)

【提要】 骨肉瘤发病率在儿童和青少年恶性肿瘤中居首位，肺部转移率高，仅行手术治疗的患者存活率较低。免疫疗法具有肿瘤免疫杀伤特异性，被认为是最有可能提高癌症患者生存率的治疗方法之一，可作为骨肉瘤新的治疗方向。本文就骨恶性肿瘤的生物学特点、骨肉瘤肺部转移的机制以及免疫疗法的机制进行综述。

骨肉瘤好发于15～25岁的青少年，以男性患者居多，其发病率在儿童和青少年恶性肿瘤中居首位。骨肉瘤好发于长骨干骺端、股骨远端和胫骨近端，具有很强的侵蚀性，肺部转移率高达20%～25%，由于缺乏高效的药物治疗，骨肉瘤一旦复发或转移，5年存活率仅为20%[1-2]。

近年来，肿瘤免疫疗法受到人们的广泛关注，且被认为是最有可能提高癌症患者生存率的治疗方法之一。研究发现，骨肉瘤局部CD8+侵蚀性淋巴细胞的比例明显高于其他肉瘤亚型，且浸润程度与生存率呈正相关[3]。骨肉瘤基因高度不稳定，其瘤细胞表面常表达程序性细胞死亡蛋白1配体(programmed cell death ligand 1,PD-L1)，这提示程序性细胞死亡蛋白1(programmed cell death protein 1,PD-1)/PD-L1轴的抑制剂具有潜在的治疗价值[4]。此外，多种癌症相关细胞表面蛋白可以作为抗体靶向用于肿瘤免疫治疗，其中米法莫肽是目前的研究热点之一[5]。米法莫肽是一种细菌细胞壁的类似物，可以通过活化单核细胞和巨噬细胞来刺激肿瘤免疫杀伤，从而抑制肿瘤的发展。目前，欧洲已经批准米法莫肽用于治疗骨肉瘤，其临床随机Ⅲ期实验已证实，在常规化疗的基础上增加米法莫肽能有效提高骨肉瘤患者的生存率[5]。因此，了解骨肉瘤的发生发展过程以及免疫治疗的新进展，对提高患者的存活率至关重要。本文就骨恶性肿瘤的生物学特点、骨肉瘤肺部转移的内在机制以及骨肉瘤免疫疗法的机制进行综述，为骨肉瘤的治疗提供新思路。

1 骨恶性肿瘤的生物学特点

骨恶性肿瘤的发生和发展主要受致癌因素和癌细胞与周围微环境之间的相互作用的影响。普遍认为，骨恶性肿瘤的主要来源为间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)，MSC在分化期间可能发生基因突变(P53、Rb等)，这增加了MSC转化为癌细胞的风险，最终导致恶性成骨细胞或恶性软骨细胞的出现。与其他非恶性同类肿瘤相比，骨肉瘤细胞和软骨肉瘤细胞能特异性表达Runx2和Sox9[6]，甚至可以通过这种主基因的表达明确MSC癌变过程中的倾向性[7]。因此，骨肉瘤细胞可不同程度表现出成骨细胞分化过程中的特性，例如骨肉瘤细胞可以表达成骨细胞标记物(碱性磷酸酶、骨钙蛋白或骨涎蛋白)，也可以表现出促进类骨质组织形成和活化细胞外基质的能力。此外，软骨肉瘤细胞还具有软骨细胞的特征，可以表达软骨细胞标记物(如Ⅱ型胶原蛋白或聚集蛋白聚糖)，也可以产生软骨基质，将恶性软骨细胞包裹在其中[7]。目前普遍认为，骨肉瘤和软骨肉瘤形成的原因是由MSC分化受损所致，但尤文肉瘤的起源仍颇受争议。实际上，尤文肉瘤细胞可特异性表达融合蛋白，该蛋白是由2号染色体上的尤文肉瘤基因和表达序列标签家族基因之间染色体发生易位而产生[8]。然而，由于尤文肉瘤在骨中的发病位置复杂，且尤文肉瘤FLI1基因在尤文肉瘤细胞中沉默，导致尤文肉瘤的起源难以确定[8]。目前，关于尤文肉瘤的起源存在3种假设，即神经嵴干细胞[9]、胚胎骨软骨祖细胞[10]和MSC[11]。已有学者对骨恶性肿瘤的发病机理等进行研究，但仍未完全阐明[12]。

2 骨肉瘤肺转移的内在机制

仅进行手术治疗的骨肉瘤患者5年存活率不足20%，采用手术与化疗联合治疗后5年存活率可提高至70%，但一旦发生转移(肺部转移常见)，患者5年生存率又降低至20%[13]。因此，了解骨肉瘤从骨骼部位(原发病灶)扩散到肺组织的内在机制，有助于预防骨肉瘤转移或特异性杀伤转移性病变，提高疗效，改善预后[14]。目前已明确部分涉及骨肉瘤转移的分子机制。研究显示，WNT/β-连环蛋白途径在骨肉瘤原发灶中被激活并促进癌细胞的早期转移，包括促进骨肉瘤细胞侵袭、趋化和外渗[15]，阻断该途径对抑制骨肉瘤的转移具有重要的意义[16-17]。还有研究显示，Notch信号途径可促进骨肉瘤的转移，γ-分泌酶抑制剂可以阻止这一类转移的发生和发展[18]。此外，骨肉瘤细胞高度表达埃兹蛋白，埃兹蛋白可以将肌动蛋白细胞骨架与细胞外基质连接起来，并作为磷脂酰基醇3-激酶/蛋白激酶信号传导的支架，促进骨肉瘤的转移；埃兹蛋白的抑制剂具有阻断骨肉瘤细胞侵袭并抑制转移的作用[19]。原发病灶微环境中的一些细胞因子(间质源性转化生长因子β和白细胞介素6)可以通过细胞核因子κB活化因子/细胞核因子κB受体活化因子信号通路活化细胞核因子κB，发挥促进骨肉瘤发生和发展的作用[20]。由肿瘤细胞分泌的ΔNp63衍生物白细胞介素6和白细胞介素8可促进骨肉瘤转移并定植于肺部[17]，靶向阻断该途径能有效防止骨肉瘤转移[21]，目前此途径的临床试剂已经进入临床阶段。此外，许多肺部特异性代谢过程在骨肉瘤定植中发挥重要作用，包括转移相关gp78的上调[22]、蛋白激酶C激活[23]或mTOR途径激活[24]等。因此，阐明骨肉瘤肺转移过程的内在机制，对骨肉瘤的治疗和预防具有重要意义，但相关研究进展缓慢，且需要投入较大的人力和物力，目前可能还存在很多重要的途径仍未发现，进一步研究已发现的机制和疗法，或可为发现更有效的骨肉瘤治疗方式，提高患者的生存率提供帮助。

3 肿瘤免疫疗法

人类免疫系统是机体内一种高度复杂的防御系统，由多种细胞参与并共同作用以抗击外来的威胁(例如感染、肿瘤)，同时保持自身免疫稳定。传统化疗的靶向是恶性增殖细胞，但免疫疗法能准确靶向到癌细胞本身，因此，与化疗相比，免疫治疗的针对性更强。免疫系统与癌症之间的相互作用较复杂，包括免疫监视、免疫细胞浸润和肿瘤细胞溶解，但是肿瘤细胞可以通过释放抑制性细胞因子和下调细胞表面标志物的表达来抑制免疫反应，目前将这种现象称为癌症“免疫编辑”，由消除、平衡和逃避3个不同阶段组成[25]。消除主要涉及发现癌症特异性抗原、形成肿瘤特异性T细胞、破坏肿瘤细胞等过程。但一些癌细胞可以在消除阶段存活并进入平衡阶段，进入平衡阶段的癌细胞有可能适应免疫系统长期的肿瘤特异性应答，并保持休眠状态，最后可能发生进化并实现免疫逃逸，从而增殖[25]。肿瘤细胞免疫逃逸的机制包括肿瘤抗原表达缺失、来自癌细胞表面的人白细胞抗原下调、调节性T细胞或肿瘤相关的M2巨噬细胞募集等，这些机制都具备免疫抑制作用，可上调T细胞上抑制性受体(如细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4、PD-1)或肿瘤细胞上抑制性配体(如PD-L1)的表达，从而抑制免疫反应[26]。免疫疗法旨在抵消这些逃逸现象，增强患者的免疫功能，从而识别和破坏癌细胞，其相关机制主要涉及以下几种物质。

3.1 针对细胞表面蛋白的抗体 骨肉瘤细胞表面存在多种抗原，这些抗原可以作为肿瘤免疫治疗的靶向。已有研究证实，肿瘤免疫治疗可有效治疗神经母细胞瘤，这给针对癌细胞表面蛋白的抗体靶向治疗带来了希望[25]。其原理是将单克隆抗体与肿瘤细胞表面抗原结合，并激活自然杀伤细胞和巨噬细胞释放细胞毒性物质，从而针对性地杀伤肿瘤细胞，这个过程也被称为抗体依赖性细胞毒作用。此外，双特异性T细胞链接器是一种含有两个单链可变区基因片段的抗体，可以通过柔性接头将T细胞上的CD3受体与肿瘤抗原紧密连接，导致T细胞活化并杀伤癌细胞[27-28]。将抗体与细胞毒性剂(如维多汀)链接在一起，也可用于癌细胞的特异性化疗[29]。

3.2 肿瘤疫苗和树突状细胞 肿瘤疫苗包括肿瘤细胞本身、溶解产物、蛋白质、DNA、RNA和肽类等。肿瘤疫苗是癌症免疫疗法的早期方式之一，其原理是通过暴露(接种)肿瘤抗原诱导肿瘤特异性免疫反应。树突状细胞是抗原呈递细胞，具有活化T细胞并引起细胞毒性T淋巴细胞增殖的能力[30]。癌症患者体内成熟的树突状细胞往往含有特异性颗粒(如肿瘤细胞裂解物)，将其离体后添加免疫佐剂然后重新注射到患者体内，可有效增强肿瘤的免疫杀伤作用[31]。

3.3 溶瘤病毒 溶瘤病毒是由基因工程制造的一种弱化病毒，其特点是仅在恶性细胞中复制。由于溶瘤病毒不依赖于特定的肿瘤细胞抗原，因此非常适用于实体肿瘤的治疗，其除了能特异性发挥肿瘤细胞的毒性作用外，还可促进肿瘤微环境的炎症反应，进一步促进抗原呈递和抗原呈递细胞成熟，增强了肿瘤杀伤作用[32]。

3.4 过继性细胞疗法 过继性细胞疗法是通过细胞溶解细胞刺激机体发生抗肿瘤反应的一种免疫疗法[30]，旨在抵消肿瘤细胞的各种免疫逃逸。例如，恶性肿瘤细胞可以通过下调人白细胞抗原和其他肿瘤特异性抗原，使其不被T细胞识别。为了解决这个问题，可以对T细胞进行设计，增强其对特定抗原的亲和力，而不需要通过人白细胞抗原的呈递也可以进行肽识别。这些经过基因工程改造的T细胞被称为嵌合抗原受体T细胞，它由细胞外结构域(包含针对肿瘤表面特异性抗原的单克隆抗体)、间隔结构域、跨膜结构域和细胞内信号转导链共同组成[33]。研究发现，采用CD3和CD28抗体与重组白细胞介素2活化骨肉瘤患者外周血中的单核细胞，然后用编码靶抗原的逆转录病毒颗粒(如人类表皮生长因子受体2)进行转导，再用白细胞介素2进一步扩增T细胞系，测试其免疫特异性后再回输给患者，可增强骨肉瘤的免疫杀伤能力[27]。

过继性细胞治疗也可以选用自然杀伤细胞和肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte,TIL)。自然杀伤细胞是先天免疫系统中的淋巴细胞，具有细胞毒性和调节功能。与T细胞和B细胞不同，自然杀伤细胞可以在没有免疫暴露的情况下事先识别目标。TIL是过继性细胞疗法的另一种形式，在肿瘤抗原的帮助下TIL可以高度特异性地迁移到肿瘤中，并直接杀死肿瘤细胞，同时释放细胞因子，进一步介导抗肿瘤反应[34]。

3.5 检查点抑制剂 由于恶性肿瘤细胞可以通过抑制检查点配体的免疫反应而逃避免疫监视，在没有经过离体扩增的情况下，内源性TIL通常无法完全抑制肿瘤的生长[35]。检查点抑制剂可以重新激活T细胞介导的肿瘤抗原特异性反应，并逆转这一现象，其机制是通过组织相容性复合物激活机体对新抗原的反应[28]。虽然目前尚不能证实骨肉瘤复杂的基因组和染色体的不稳定性是否会引起基因突变，但是其高度的遗传不稳定性很可能产生新的免疫介导杀伤基质表位，从而增强检查点抑制剂(如细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4、PD-1和PD-L1的抑制剂)用于肿瘤治疗的潜力[36-37]。

细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4是在调节性T细胞和记忆T细胞上表达的跨膜糖蛋白受体，在与树突状细胞上的CD80/86链接后可以抑制免疫功能[36]。与健康人相比，骨肉瘤患者的细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4表达增加，因此人们提出，细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4抑制剂可以用于骨肉瘤的治疗[38]。PD-1是在T细胞上表达的另一种跨膜免疫球蛋白家族成员，其在慢性活化的T细胞中表达最高[39]，PD-1是免疫系统的“刹车”，可以抑制细胞毒性T淋巴细胞并激活Treg细胞，且重要的是，其配体(PD-L1)在骨肉瘤肿瘤细胞和免疫细胞表面均有表达[37]。

4 小 结

免疫疗法为骨肉瘤的治疗带来了新的曙光，目前已有学者致力于研究各种免疫疗法应用于肿瘤治疗的效果和新药物的研发。然而，由于免疫系统的复杂性和肿瘤特异性微环境的细微差别，且肿瘤本身也会通过多种途径抵抗免疫疗法，使得免疫疗法在骨肉瘤中的应用研究进展缓慢。进一步阐明现有免疫疗法的抵抗机制，开发和测试合理的联合疗法(手术+化疗+抗转移/复发+免疫疗法)对提高骨肉瘤的治疗效果和患者的生存率至关重要，免疫疗法有望成为骨肉瘤治疗的新突破。