lncRNA-miRNA与胶质瘤作用机制的研究进展

柴洋 综述 谢明祥 审校

(遵义医科大学附属医院神经外科，贵州 遵义 563003)

中枢神经系统(CNS)中最具侵袭性的原发性肿瘤是神经胶质瘤，约占所有侵袭性神经系统肿瘤的50%～80%[1]并且逐年递增[2-3]。其中，WHO定义为Ⅳ级的胶质母细胞瘤(GBM)，约80%为浸润性星形细胞瘤，是目前病理诊断级别恶性程度最高的恶性胶质瘤。人类基因组中98%以上的核苷酸序列不编码蛋白质，其转录产物为ncRNA(ncRNA)。各种研究表明，ncRNA据片段大小划分出来的微小RNA (miRNA)和长链非编码RNA (lncRNA)，这两种RNA调控多种蛋白编码基因。lncRNA可以作为分子诱饵，通过直接吸附miRNA来有效抑制miRNA与靶mRNA的相互作用。本文主要对lncRNA-miRNA与胶质瘤作用机制作一综述。

1 lncRNA及其功能

1.1lncRNA 自20世纪90年代以来，Okazaki等对老鼠的全长cDNA进行大规模测序时发现了lncRNA到在老鼠中发现了H19和X(染色体)失活特异性转录物(Xist)，随着越来越深入的研究，过去被当做“克隆文物”或者转录“噪音”的lncRNA重新获得了人们的重视[4]。经科研人员多年的研究发现，lncRNA的长度超过200个核苷酸(nt)，在RNA聚合酶Ⅱ的作用下转录合成，但lncRNA不参与蛋白质的翻译过程且具有空间和时间的特异性。除了表达水平很低，核苷酸的数量比较少以及外显子虽然长度更长但数量少以外，其他很多方面都与mRNA的序列类似[5]，同样包含5’端帽结构，3’端多聚腺苷酸尾结构，内含子以及剪接位点。

多数lncRNA的二级结构相对保守，具有独特的剪接形式以及特定的亚细胞定位，这种空间和时间的特异性可以说明lncRNA是具有许多功能的,但这种功能特性相对于许多miRNA和蛋白质来说很难完全确定。根据lncRNA相对于蛋白编码基因进行转录的位置，可将其分为六类lncRNA：①Sense lncRNA(正义链RNA)：与编码基因的一个或多个外显子重叠；②Antisense lncRNA(反义链RNA)：与互补链上的转录产物进行部分或完全的互补；③Intronic transcript lncRNA(内含子lncRNA)：由基因的内含子产生；④Bidirectional lncRNA(双向lncRNA)：由与蛋白编码基因相同的启动子转录而来，但是方向相反； ⑤Long intergenic noncoding RNA(长基因间lncRNA，lincRNA)：由位于蛋白质编码基因之间的序列独立转录产生；⑥Enhancer lncRNA(增强子lncRNA)：由位于增强子区域的蛋白编码基因产生。根据lncRNA在肿瘤发生及其发展过程中所发生的作用，可将lncRNA划分为癌基因以及抑癌基因lncRNA。值得注意的是，目前是不能仅根据序列特征或者结构形式来准确推测它们在其基因调控中所起的作用。

1.2lncRNA的功能 lncRNA不仅仅维持正常生理过程，与肿瘤发生、发展以及转移的关系也被广泛报道，因此成为近期的研究热点。在表观遗传学水平上，可通过DNA甲基化、介导染色质重构以及组蛋白修饰，影响下游基因的正常表达。在转录水平上，位于启动子区的编码基因转录生成的lncRNA，可作为顺势作用原件去干扰下游基因的转录，进而影响mRNA的生成。另外，lncRNA可直接结合转录因子使其结构发生改变，转录因子因其活性降低而无法与目标基因结合，进而抑制了目标基因的表达。在转录后水平上，lncRNA通过与miRNA的前体(pre-miRNA)结合并进行配对，从而形成双链复合物，影响其剪接、核内运输以及降解等来调控基因的表达。lncRNA也可诱导某些基因位点形成异染色体，从而引发染色体重塑进而调控基因表达。

lncRNA因其不仅具有功能保守和调控严格的特性，还由于其空间和时间的特异性，使得lncRNA在正常生长发育以及某些恶性疾病的发生早期及其发展中都能起着重要的调控作用。从在小鼠体内发现了H19和Xist，直到最近十年，lncRNA在在癌症发展中的作用才被提出来[6]，由于在体液中很容易检测到lncRNA，因此lncRNA作为癌症早期诊断、预后和癌症治疗的关键生物标记物尤其具有可观的应用前景研究意义[7，8]。

2 miRNA及其功能

2.1miRNA 自1993年Lee等人在秀丽隐杆线虫中发现的第1个miRNA到2001年Ambros实验室创造了miRNA这个术语再到let-7的发现，就此展开了对miRNA的研究。miRNA在真核生物中广泛存在，长度仅为18～25个nt，与lncRNA相同，都不参与蛋白质的翻译过程即都是不编码蛋白质的RNA。miRNA必须经过一个从初级(pre-)到前体(pri-)最后成熟的过程。首先，在细胞核中，编码miRNA的基因在RNA聚合酶Ⅱ的作用下转录生成加帽和多聚腺苷酸尾的初级miRNA(pri-miRNA)。接着pri-miRNA被酶-蛋白复合体：RNase Ⅲ DROSHA-DGCR8剪切成前体miRNA(pre-miRNA)，pre-miRNA是3’端有2个nt突出的发夹结构。然后生成的pre-miRNA经转运蛋白Exportin-5-RanGTP转运至细胞质后，最后被RNase Ⅲ DICER再次切割生成5’端有磷酸基团，3’端是羟基的成熟miRNA[9]。 多数miRNA序列高度保守，具有时间、空间、组织[10]以及疾病特异性。

2.2miRNA的功能 miRNA可调控约1/3的人类基因，多数成熟的miRNA与人类蛋白质AGO2结合并可以生成一种基因沉默复合体(RNA induced silencing complex，RISC)[9]，RISC通过miRNA 5’端的核苷酸序列与靶mRNA 3’端非翻译区(untranslated region，UTR)特异结合后，可阻止靶基因的翻译或直接降解靶基因。少数成熟的miRNA并不通过阻遏mRNA的翻译行使调控作用，而是通过与核糖体蛋白mRNA的5’-UTR结合来促进核糖体蛋白合成。迄今为止，所有研究均表明miRNA在干细胞分化、发育、肿瘤的发生发展以及转移耐药中发挥着强大的基因调控作用，因此，miRNA可以作为诊断、预后和治疗的生物标记物[11]。miRNA因具有组织特异性而同时既可作为癌基因，又可作为抑癌基因。在耐药方面，miRNA可通过影响细胞自噬，导致靶基因表达自噬蛋白减少并增加细胞毒性起作用。并且经研究证明miRNA干预多条经典信号通路发挥其基因调控的作用，如作用于经典的p53和Wnt-β-catenin。

3 lncRNA与miRNA的相互作用

3.1lncRNA调控miRNA

3.1.1lncRNA作为miRNA的前体或宿主 pre-miRNA可通过lncRNA经细胞内剪切，或者其他基因在转录生成lncRNA的同时转录生成，但要获得成熟的miRNA，还需要进一步的加工才能发挥作用。H19的加工产物miR-675，其碱基主要是C和G，而H19的碱基主要是G。虽然miR-675的前体是H19，但其两者的序列、核苷酸组成有所不同，这可能是发挥不同功能所需要的结构基础[12]。

3.1.2lncRNA与miRNA竞争性结合mRNA lncRNA和miRNA可竞争性与靶mRNA的3’UTR结合,进而抑制miRNA对靶基因的负向调控作用。β分泌酶编码基因1(BACE1)是一种膜结合的天冬氨酸蛋白酶。能转录出一条长约2kb的Antisense lncRNA(BACE1-AS)。BACE1-AS水平上调增加BACE1的稳定性，并与BACE1 mRNA竞争性结合以抑制miR-285-5p结合并沉默BACE1的作用。

3.1.3lncRNA作为miRNA的海绵或者诱饵 lncRNA作为竞争性内源性RNA(ceRNA)以诱饵的方式吸附特定的miRNA，miRNA与lncRNA结合后既可通过顺式作用直接作用于该lncRNA，也可通过反式作用间接作用于其他RNA，进而间接抑制miRNA靶基因表达的这种方式被称为“海绵效应”(miRNA sponge)，lncRNA称为“分子海绵”。

在经典的lin28/let-7信号通路中，lin28与let-7的前体结合。lin28有两个高度保守的结合RNA的结构域，一个是位于氨基末端的冷休克结构域(CSD)，另一个是位于羧基末端的锌指结构域(ZKD)，ZKD由两个串联的 CCHC(Cys-Cys-His-Cys)组成。pre-let-7 preE的loop环绕lin28的CSD，pre-let-7的3’-stem GGAG模体与lin28的ZKD结合后，lin28抑制let-7成熟从而实现lin28对let-7的抑制。

3.2miRNA调控lncRNA miRNA通过直接或间接作用于lncRNA，降低lncRNA的稳定性，进而调节lncRNA并影响生物进程。由于lncRNA也有3’UTR，因此miRNA可像作用与mRNA一样与lncRNA的3’UTR结合从而直接抑制lncRNA。miRNA也可通过调节DNA甲基化酶(DNA methylase，DNMT)间接对lncRNA起调控作用。

4 linRNA-miRNA与胶质瘤的作用机制

虽然lncRNA与miRNA都可单独作用于mRNA，但两者的调控网络并不是相互独立的。在胶质瘤的发生发展中，lncRNA与miRNA的调控机制相互交织，并以依存的关系共同形成一个庞大的调控环路。

H19是母源性印迹基因，既有致癌又有抑癌的作用。研究人员发现，H19及由其衍生的miRNA-675在一些高级别恶性胶质瘤中的表达量明显要高于低级别恶性胶质瘤。H19通过其生成的miRNA-675促进胶质瘤细胞的侵袭作用。更有实验证实：抑制H19将抑制胶质瘤。荧光素酶实验检测到H19过表达以及miR-140下调，说明miR-140作为H19的靶点发挥促进胶质瘤细胞生长的作用[13]。血管生成抑制蛋白2(VASH2)与血管内皮生长因子(VEGF)共同调节胶质瘤血管的生成。VASH2通过H19-miR-29a通路上调以促进胶质瘤血管的生成。

母系表达基因3(MEG3)是一种抑制脑肿瘤的lncRNA，在脑胶质瘤细胞中的表达低于正常大脑组织。miR-19a主要发挥是其作为致癌基因的作用，促进胶质瘤的增殖、迁移和侵袭。PTEN基因(PTEN)，又称为MMAC1和TEP1。miR-19a通过抑制PTEN起作用。MEG3通过抑制miR-19a的表达抑制胶质瘤细胞的增殖，使细胞周期停滞在G0/G1期[14]。此外，miR-93在胶质瘤中呈现高表达，可通过磷脂酸肌醇3激酶/蛋白激酶B(P13K/AKT)信号通路促进恶性胶质瘤的早期发生及其发展，MEG3可通过抑制miR-93，进而抑制P13K/AKT信号通路最终发挥抑制恶性胶质瘤发生的作用[15]。

肺腺癌转移相关转录本1(MALAT1)是一种核内lncRNA，最初在研究其与人体肺癌转移关系时才被发现。与正常人大脑神经组织相比，在恶性胶质瘤中显著升高，并与肿瘤恶性程度、大小成正比，与胶质瘤患者的总生存期(OS)成反比。MALAT1通过抑制miR-101增加其靶基因STMN1、RAB5A以及ATG4D的表达。即通过MALAT1-miR-101-STMN1/RAB5A/ATG4D调控网络激活胶质瘤细胞的自噬，并通过上调胶质瘤细胞中STMN1、RAB5A和ATG4D的表达而达到促进胶质瘤细胞增殖的作用[16]。另外，发现敲除MALAT1能够上调miR-140，削弱胶质瘤细胞的免疫屏障作用，由此可有效提高胶质瘤细胞对药物化疗的免疫反应性。近期研究还初步发现,MALAT1还可通过抑制miR-155的表达对胶质瘤细胞起作用，敲低MALAT1可促进胶质瘤细胞的凋亡。

胶质瘤干细胞(GSCs)因其强大的自我更新以及分化能力，常常导致极差的预后以及短期内复发。lncRNA能够调节GSCs：MALAT1可与miR-129结合，通过降低miR-129提高其靶基因SOX2的表达，调节GSCs的特性及胶质瘤细胞的形成、增殖和迁移[17]。在GSCs中呈高表达的核富集常染色体转录物 1(NEAT1)，则是通过miR-107-CDK6通路，激活miR-107使得周期蛋白依赖性激酶(CDK)失活。NEAT1在敲除后，细胞周期可停滞在G1期[18]。

从X染色体失活中心转录得来的Xist，其主要作用是调节X染色体的失活。Xist在恶性胶质瘤中呈现高表达，促进胶质瘤细胞的增殖和侵袭，并增加胶质瘤细胞对化疗药替莫唑胺的耐药性[19]。其可能机制是Xist作为miR-137的ceRNA，结合并抑制miR-137，促进其靶基因Rac1的表达[20]。另外，研究证实敲除Xist可上调miR-152，达到抑制胶质母细胞瘤干细胞的作用。

以上是一些经典的lncRNA-miRNA在胶质瘤中的作用机制。另外经实验研究证实：与胶质瘤恶性程度正相关的lncRNA不仅促进胶质瘤的发生及其发展，并且与患者的不良愈后显著相关，如：lncRNA-ATB通过抑制miR-200a进而促进TGR-β2的表达起作用；同源异形框转录反义基因间RNA(hox transcript antisense intergenic RNA，HOTAIR)作为miR-15b的ceRNA，通过HOTAIR-miR-15b-p53轴起作用，而miR-15b既可通过单独抑制HOTAIR，又可通过促进p53基因的表达起作用[21]。

而另一些lncRNA抑制恶性胶质瘤细胞增殖，在恶性胶质瘤中的表达明显低于正常大脑神经组织：癌症易感性候选基因2(CASC2)、牛磺酸调节基因(Taurine Up-Regulated 1，TUG1)、lncRNA Cas5和lncRNA RP5-833A20.1等。CASC通过抑制miR-21的表达起作用。TUG1是miR-R26a的分子海绵，miR-R26a通过结合PTEN的3’UTR启动TUG1-miR-R26a-PTEN轴抑制胶质瘤。但胶质瘤细胞因为需要营养物质，因此其血管生成受到调节，TUG1-miR-299通过调节VEGF促进胶质母细胞瘤的血管生成[22]。lncRNA Cas5通过抑制miR-222起作用。lncRNA RP5-833A20.1通过抑制NFIA的mRNA和蛋白水平以增强NFIA启动子的甲基化，增加miR-382-5p的表达起作用。

5 小结与展望

胶质瘤是最常见的原发性中枢神经系统恶性肿瘤，复发和死亡率均很高。胶质瘤患者5年平均生存率仅为20%，其最具生物侵袭性的多形性胶质母细胞瘤(GBM)，其患者的5年平均生存率<3%。即使进行了积极的手术、放化疗，GBM患者的预后仍然很差，诊断后的中位OS只有12～15个月。目前GBM发生和发展的基因及其分子学机制尚不完全清楚，因此，在基因和分子水平上掌握胶质瘤的发生发展机制至关重要。充分了解并深入分析lncRNA-miRNA在胶质瘤早期发生及其发展过程中的作用机制有助于为胶质瘤患者的早期诊断和治疗提供确切可靠的科学依据。