盐碱土旱田改水田后其理化性质与微生物多样性差异

霍朝晨，赵铎，何水清，钟万锦，王建豪，晏磊，王伟东

（黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆 163319）

土壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分，在土壤有机物质分解和养分释放、能量转移等生物地化循环中起着重要作用[1]。但是，土壤中有大量未培养微生物目前无法探知其功能，不依赖于纯培养的现代分子生态学方法是研究土壤微生物多样性和功能的有效方法。土壤微生物参与土壤中物质转化和能量流动，促成土壤形成。同时，微生物自身还含有一定数量的C、N、P、S 等，可看成是一个有效养分的储备库，对土壤肥力的提高有重要作用[2]。盐碱地由于土壤质量差、作物产量低，在全球分布广泛，已成为土壤退化中的世界性难题，土壤微生物可作为评价盐碱地土壤质量变化的一个重要指标[3]。

黑龙江省是我国的产粮大省，水稻种植面积200多万hm2。大庆市地处松嫩平原，地势平缓，低洼易涝，土质以黑钙土、草甸土和沙壤土为主，非常适合水田生产，且水田灌区控制面积广阔，适宜水田开发的土地资源较为丰富。近年来，随着水稻的经济效益的提高，农民把旱田改为水田，把低洼易涝的土地、盐碱地变为肥田，水田所占比重大幅提高。而国内关于旱改水的研究在旱改水可行度、对生态环境影响和土壤微生物数量变化的分析方面较集中[4-8]，对于旱改水对土壤微生物群落结构影响的研究鲜有报道。

为了解盐碱土壤旱田改水田后土壤微生物群落结构的变化，研究采用16S rRNA 基因扩增子高通量测序技术对土壤细菌和古菌多样性进行了分析，结合土壤理化性质明确旱田改水田之后土壤微生物群落结构的变化以及微生物群落与环境因子的关系，为盐碱土旱改水提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 试验区概况

大庆市位于黑龙江省西南部，松嫩平原中部。该区属中温带大陆性季风气候，年平均气温4.2 ℃，年降水427.5 mm。研究区域位于大庆市高新区（旱田：46°58′32″N，125°17′34″E；水田：46°58′39″N，125°17′36″E），土壤类型为盐碱土，旱田种植品种为大豆，改水田后种植品种为水稻。

1.1 试验材料

选取旱田和改水田年限为3 年的地块，旱田和水田均在秋收后进行取样，每种土壤取样3 次，并将旱田和水田土壤样品分别命名为h 和n。采用5 点取样法，取0～20 cm 深度的旱田和水田土壤500 g，一部分样品风干，用于测定理化性状，一部分放置于-80 ℃超低温保存箱（中国HAIER DW-86L338J）保存，用于微生物分析。

1.3 理化指标与测定方法

1.3.1 土壤pH 测定

土壤pH 值测定采用国标法（NY-T 1377-2007）测定[9]。待测土壤经室温风干后，研磨过2 mm 筛，称取10 g 过筛后土壤，按水土比5∶1 比例加水，搅拌5 min 后，室温静置1～3 h，用微型pH 计（日本HORIBA）测定土壤pH 值。

1.3.2 土壤水溶性盐含量测定

土壤水溶性盐含量采用残渣烘干法（NY/T 1121.16-2006）进行测定[10]。待测土壤经室温风干后，研磨过2 mm 筛，称取50 g 过筛后土壤，按水土比5∶1比例加水，振荡3 min 后，过滤，用移液管吸取100 mL浸出液，注入已干燥、称重的烧杯，放于105 ℃烘箱烘干，当残渣出现黄褐色时，应加15%双氧水1～2 mL，继续烘干，直至黄褐色消失。计算公式：含盐量（%）=（m杯+盐-m杯）/m样*100。

1.3.3 土壤有机质含量测定

土壤有机质含量采用重铬酸钾氧化法（NY-T 1377-2007）进行测定[9]。待测土壤经室温风干后，研磨过2 mm 筛，称取0.1 g 过筛后土壤，分别添加5 mL 浓硫酸（98%，化学纯）和5 mL 重铬酸钾（0.8 mol·L-1），置于170 ℃～180 ℃磷酸浴中沸腾计时5 min，冷却后滴2～3 滴邻菲罗林指示剂，使用0.2 mol·L-1硫酸亚铁进行滴定。

1.3.4 土壤全氮、有效磷、速效钾含量测定

土壤全氮含量采用半微量凯氏法（NY/T 53-1987）进行测定[11]；土壤速效钾含量采用中性乙酸铵溶液浸提、火焰光度计法（NY/T 889-2004）测定[12]；土壤有效磷含量采用碳酸氢钠法（LY/T 1233-1999）测定[13]。

1.4 微生物多样性分析

1.4.1 土壤总DNA 的提取

采用改良的氯苯法进行总DNA 提取[14]，所提取总DNA 采用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA 完整程度，其中电泳电压为120 V，时间15 min，同时采用超微量分光光度计（美国Thermo Nanodrop 2000c）对其浓度进行测定，选取DNA 总量超过500 ng 和OD260/280 在1.8～2.0 之间以及琼脂糖凝胶电泳主带清晰的DNA 样品。

1.4.2 引物的选取、扩增条件和测序

针对16S rRNA gene V4 区作为特异性扩增目标区域，细菌16S V4 区引物为515F（5′-GTGCCAGCM GCCGCGGTAA-3′）和909R（5′-CCCCGYCAATTCMT TTRAGT-3′）[14]，古菌引物为344F（5'-ACGGGGYGC AGCAGGCGCGA-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGG TWTCTAAT-3′）[15]。扩增反应体系（20 μL）为PCR supermix 10 μL，正向引物（10 μM）1 μL，反向引物（10 μm）1 μL，DNA 模板2 μL，ddH2O 6 μL。PCR 反应条件为95 ℃预变性2 min，98 ℃变性15 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸2 min，72 ℃最终延伸5 min，28个循环。

1.4.3 测序数据处理

利用Qiime（version 1.9.0）对原始序列进行过滤处理，得到所有优质序列，随后利用Usearch（version 8.0）去除所得嵌合体，获得有效序列。利用Qiime 中cd-hit 方法对所有样品的有效序列进行聚类，以97%相似度为阈值将序列聚类成OTU，同时选取OTU 的代表序列，并去除其中的singleton（所有样品中只有一条序列的OTU）。利用Qiime 软件对OTU 代表序列进行物种注释，使用Greengenes 作为参考数据库。利用Qiime 对ACE 指数、Chao1 指数、Simposn 指数和Shannon 指数进行Alpha 多样性分析。根据OTU 表生成加权的Unifrac 距离矩阵，绘制PCoA 主坐标分析图进行Beta 多样性分析。结合土壤理化性质测定结果，利用Canoco 5.0 软件绘制RDA 冗余分析图。利用Origin 2017 软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 盐碱土壤旱田改水田后对土壤理化性质的影响

土壤理化性质是影响土壤微生物活性、多样性及群落结构的主要因素。由表1 可以看出，盐碱土旱田改水田后，土壤的pH 和有效磷含量显著升高（P=0.05），而对土壤的水溶性盐、有机质、全氮、速效钾含量没有显著影响。

表1 盐碱土旱田和水田的土壤理化性质Table 1 Physical and chemical properties of soil in saline-alkali soil dryland and paddy field

2.2 盐碱土旱田改水田后对土壤细菌和古菌多样性的影响

2.2.1 Alpha/Beta 多样性分析

Chao1 指数是反映物种丰富度的指标，指数越大代表菌群丰富度越高；Shannon 指数和Simpson 指数是反映代表菌群多样性的指标，指数越高代表菌群多样性越高。旱田细菌的Chao1 指数和Shannon 指数高于水田（表2），而水田古菌的Chao1 指数和Shannon 指数高于旱田（表3），说明盐碱地旱田改水田后，细菌的丰富度和多样性降低，而古菌的丰富度和多样性升高。

表2 盐碱土壤旱田和水田细菌的Alpha 多样性指数Table 2 Alpha diversity index of bacteria in arid and paddy fields in saline-alkali soils

图1 为土壤样品细菌基于加权Unifrac 距离的PCoA 图，图2 为土壤样品古菌基于加权Unifrac 距离的PCoA 图，由图中可以看出，两组土壤样品间距离较大，说明旱田改水田后，土壤在细菌和古菌的物种组成、物种丰度上有着明显的差异。

表3 盐碱土壤旱田和水田古菌的Alpha 多样性指数Table 3 Alpha diversity index of ancient bacteria in arid and paddy fields in saline-alkali soils

图1 PCoA 主坐标分析（细菌）Fig.1 PCoA main coordinate analysis（bacteria）

图2 PCoA 主坐标分析（古菌）Fig.2 PCoA main coordinate analysis（archaea）

2.2.2 细菌多样性分析

根据高通量测序结果，门的分类水平上旱田和水田分别检测到31 和41 个细菌门，其中，变形菌门（Proteobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、酸杆菌门（Acidobacteria）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、浮霉菌门（Planctomycetes）、放线菌门（Actinobacteria）、硝化螺旋菌门（Nitrospirae）、厚壁菌门（Firmicutes）为优势细菌门（图3），这9 个细菌门相对丰度之和在两种样本中占比均在93%以上。通过差异性分析（P=0.05）发现，旱田改水田后，变形菌门、绿弯菌门、放线菌门的相对丰度显著升高，而芽单胞菌门、酸杆菌门、浮霉菌门的相对丰度显著降低。

图3 盐碱土壤旱田（h）和水田（n）土壤样品中门水平细菌分类注释Fig.3 Taxonomic notes on phylum level of bacteria in saline-alkali soils dry field samples（h）and paddy field samples（n）

属的分类水平上旱田和水田分别检测到375 和498 个细菌属，其中，梭状芽孢杆菌属（Clostridium）、不动杆菌属（Acinetobacter）、硫杆菌属（Thiobacillus）、贪噬菌属（Variovorax）、Flavisolibacter、Pontibacter 为优势细菌属（图4）。通过差异性分析（P=0.05）发现，旱田改水田后，硫杆菌属、贪噬菌属、不动杆菌属的相对丰度显著升高，而梭状芽孢杆菌属、Flavisolibacter、Pontibacter 的相对丰度显著降低。

图4 盐碱土壤旱田（h）和水田（n）土壤样品中属水平细菌分类注释Fig.4 Taxonomic notes on generic level bacteria in saline-alkali soils dry field samples（h）and paddy field samples（n）

2.2.3 古菌群落组成分析

门的分类水平上旱田和水田分别检测到26 和32 个古菌门，其中，泉古菌门（Crenarchaeota）、广古菌门（Euryarchaeota）、微古菌门（Parvarchaeota）为优势古菌门（图5），这3 个古菌门相对丰度之和在两种样本中占比均在70%以上。通过差异性分析（P=0.05）发现，旱田改水田后，微古菌门的相对丰度显著升高，而泉古菌门、广古菌门的相对丰度显著降低。

属的分类水平上旱田和水田分别检测到251 和320 个古菌属，其中，甲烷螺菌属（Methanospirillum）、甲烷鬃菌属（Methanosaeta）、Candidatus Nitrososphaera、Candidatus Methanoregula、Methanocella 为优势古菌属（图6）。通过差异性分析（P=0.05）发现，旱田改水田后，甲烷螺菌属、甲烷鬃菌属、Candidatus Methanoregula、Methanocella 的相对丰度显著升高，而Candidatus Nitrososphaera 的相对丰度显著降低。

图5 盐碱土壤旱田（h）和水田（n）样品中门水平古菌分类注释Fig.5 Taxonomic notes on phylum level archaea in saline-alkali soils dry field samples（h）and paddy field samples（n）

图6 盐碱土壤旱田（h）和水田（n）样品中属水平古菌分类注释Fig.6 Taxonomic notes on generic level archaea in saline-alkali soils dry field samples（h）and paddy field samples（n）

2.3 旱田和水田土壤微生物群落结构与理化性质的关系

2.3.1 细菌群落与环境因子的关系

图7 为针对旱田和水田土壤样品中细菌多样性和土壤理化性质进行冗余分析获得的的RDA 排序图。图中箭头所指方向代表了该环境因子的变化趋势；线段的长短代表了环境因子对菌群结构变化的影响；箭头与排序轴间的夹角代表着该环境因子与排序轴的相关性，相关性越大夹角越小。

由图7 所示，土壤样品中优势菌群厚壁菌门（Firmicutes）位于第一象限，变形菌门（Proteobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、硝化螺旋菌门（Nitrospirae）、放线菌门（Actinobacteria）位于第二象限，芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）位于第三象限，酸杆菌门（Acidobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、浮霉菌门（Planctomycetes）位于第四象限。pH、有机质、有效磷、速效钾集中于一二象限，水溶性盐、全氮集中于三四象限。由此分析可知，变形菌门、绿弯菌门、硝化螺旋菌门、放线菌门与有效磷、速效钾、pH、有机质成正相关；芽单胞菌门、酸杆菌门、拟杆菌门、浮霉菌门与水溶性盐、全氮成正相关。环境因子对细菌群落结构的影响从大到小依次为pH、水溶性盐、有效磷、速效钾、全氮、有机质。

图7 盐碱土壤细菌群落与环境因子RDA 图Fig.7 RDA Map of saline-alkali soil bacterial community and environmental factors

2.3.2 古菌群落与环境因子的关系

图8 为针对土壤样品中古菌多样性和土壤理化性质进行冗余分析获得的的RDA 排序图。由图所示，土壤样品中优势菌群Candidatus Methanoregula位于第一象限，Candidatus Nitrososphaera 位于第三象限，甲烷螺菌属（Methanospirillum）、甲烷鬃菌属（Methanosaeta）、Methanocella 位于第四象限。有效磷、水溶性盐集中于一二象限，速效钾、pH、有机质、全氮集中于三四象限。由此分析可知，Candidatus Methanoregula 与有效磷、水溶性盐成正相关；Candidatus Nitrososphaera、甲烷螺菌属、甲烷鬃菌属、Methanocella 与速效钾、pH、有机质、全氮成正相关。环境因子对古菌群落结构的影响从大到小依次为全氮、pH、有效磷、水溶性盐、速效钾、有机质。

图8 盐碱土壤古菌群落与环境因子RDA 图Fig.8 RDA Map of saline-alkali soil archaea community and environmental factors

3 讨论

土壤pH 是衡量土壤酸碱度、反映土壤质量的重要化学性质之一，影响着土壤的养分转化及土壤微生物的活性，进而影响土壤肥力[16]，土壤pH 的改变将直接或间接地影响营养物的可利用性[17-18]。土壤有效磷水平是影响作物产量、评价土壤肥力以及环境污染程度的重要指标之一[19]。研究表明，旱田改为水田后，pH 和有效磷含量显著上升。pH 上升原因可能是含水量变化影响了离子在固相液相之间的分配和土壤中盐类的溶解与解离，从而改变了土壤的pH[20]，或者植物残留物在微生物的分解作用下给土壤补充大量的盐基阳离子，增加了土壤的pH[21-22]。研究表明，淹水使土壤Ca2-P 型磷酸盐和Ca8-P 型磷酸盐含量提高，二者都是土壤中有效磷的重要组成部分[23]，同时在水稻种植中磷肥的施加，也可能是导致水田中有效磷含量上升的原因。

土壤微生物是土壤的重要组成部分，也是土壤和养分循环转化的动力[24]，能够及时准确地反映土壤养分状况，对土壤中养分供应起着极重要的作用[25]。研究中，盐碱土旱田改为水田后，细菌群落多样性降低，古菌群落多样性升高。这可能是由于淹水形成厌氧环境，加之pH 上升，改变了土壤的氧化还原电位，各种生物酶活性也随之改变，从而抑制了土壤中某些好氧微生物的生长。在微生物群落分析中我们发现，在门水平上，旱田的主要优势细菌为变形菌门、酸杆菌门、芽单胞菌门，与杜澄鑫等的盐碱土根际微生物群落研究结果类似[26]；水田的主要优势细菌为变形菌门，其相对丰度为40.05%，与李新的河套灌区的盐碱土研究结果一致[27]。旱田改水田后，变化最大的为变形菌门和酸杆菌门，变形菌门是细菌中最大的一门，大多数变形菌门细菌营兼性或者专性厌氧生活，因此其相对丰度显著上升，酸杆菌门中的细菌为嗜酸菌，随着改水田后土壤碱性的增强，其相对丰度显著下降。在属水平上，旱田改水田后，甲烷螺菌属、甲烷鬃菌属、Candidatus Methanoregula、Metha-nocella 的相对丰度显著升高，其中甲烷螺菌属、甲烷鬃菌属、和Methanocella 均为产甲烷古菌[28]，而已有研究发现在稻田和陆地淡水沉积物中，产甲烷菌的相对丰度较高[29-31]；不动杆菌属、硫杆菌属的相对丰度显著升高，不动杆菌属主要存在于土壤和废水中[32]，它有助于磷酸盐的累积[33]，同时，Miransari 观察到硫杆菌属可以增加磷的有效性[34]，这也可能是导致水田中有效磷含量上升的原因。

4 结论

（1）盐碱土旱田改水田使土壤pH 和有效磷含量显著升高。

（2）盐碱土旱田改水田后，土壤中细菌群落的多样性和丰富度降低，古菌群落的多样性和丰富度升高，其中变形菌门和泉古菌门为主要的优势菌门，贪噬菌属和Methanocella 为主要的优势菌属。

（3）在旱田改水田过程中，pH 是对微生物群落结构影响作用最大的环境因素，全氮含量对古菌群落结构变化相关性最大。