绿豆胰蛋白酶抑制剂对绿豆象生长发育及体内解毒酶和保护酶活性的影响

樊艳平, 党海燕, 王宏民, 郑海霞, 成小芳, 张耀文, 张仙红,*

(1.太原师范学院地理科学学院, 山西晋中 030619; 2.中华人民共和国太原海关, 太原 030006;3.山西农业大学经济管理学院, 山西太谷 030801; 4.山西农业大学植物保护学院, 山西太谷 030801;5.山西农业大学基础部, 山西太谷 030801; 6.山西省农业科学院作物科学研究所, 太原 030000)

绿豆象Callosobruchuschinensis属鞘翅目豆象科，在我国大部分省区均有发生，是绿豆、红豆、豇豆等豆科植物的主要害虫(Rackis and Anderson, 1964; 白旭光等, 2002; 金文林等, 2004)，仓内绿豆蛀蚀率高达43%～69%，被蛀蚀的豆类种子营养价值受损，商品价值大幅降低(张耀文等, 2002; Mainalietal., 2015)。而目前生产上对绿豆象多采用物理和化学方法进行防治(白旭光等, 2005; 张民照等, 2007; Gbayeetal., 2011; 仲建锋等, 2013)，但这些方法不仅会增加成本，而且还会出现农药污染及残留毒性等问题(冷廷瑞等, 2007; 陈旭波等, 2017; 袁海滨等, 2017)，因此寻找一种既高效又安全无公害的绿豆象防治方法具有很大的现实意义。

蛋白酶抑制剂是广泛存在于植物体内的一类分子量很小的蛋白质，可抑制昆虫体内蛋白酶的活性(张兵等, 2014)，使昆虫无法正常将蛋白质消化分解获得能量来源，对幼虫的生长发育有明显抑制作用(Ryan, 1990; de Sáetal., 2014)；蛋白酶抑制剂在昆虫体内还可与消化道内的蛋白酶结合形成酶抑制剂复合物阻断或减弱消化酶的蛋白水解作用，从而影响昆虫对食物的消化、吸收和利用，该复合物还能刺激昆虫消化酶的过度分泌，耗尽其体内所需的氨基酸，最终导致昆虫非正常发育或死亡(Gatehouse, 2011; Zhu-Salzman and Zeng, 2015)。昆虫体内存在着如羧酸酯酶(carboxylesterase, CarE)和谷胱甘肽S-转移酶(glutathione-S-transferases, GSTs)等之类的解毒酶，对有毒物质的分解和维持昆虫的正常生理代谢起重要作用(尹姣等, 2012)，还存在着如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、过氧化物酶(peroxidase, POD)和过氧化氢酶(catalase, CAT)等之类的保护酶，在防御外源化学物质促氧化并使昆虫免受活性氧攻击中起重要作用。研究发现，昆虫体内保护酶活性与其抗逆性均有一定的相关性(陈尚文, 2001; Djordjevic, 2004; Valavanidisetal., 2006)。

刘勇等(2000)发现，豇豆、马铃薯、水稻和玉米中的蛋白酶抑制剂可强烈影响大部分鞘翅目昆虫，尤其是仓储害虫的生长发育；谢可芳等(2002)发现，用含大豆胰蛋白酶抑制剂(soybean trypsin inhibitor, SBTI)的人工饲料饲喂棉铃虫Helicoverpaarmigera后，SBTI明显抑制幼虫生长发育速度，使幼虫体重减轻；吴国昭等(2012)的研究表明，斜纹夜蛾Spodopteralitura取食含大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI)的人工饲料后，幼虫发育历期明显延长，体内CarE和GSTs活性明显升高，对其体内SOD，POD和CAT活性变化均有一定影响；徐伟等(2019)的研究表明，抗虫大豆品种中蛋白酶抑制剂活性越高，大豆食心虫幼虫发育历期明显越长，幼虫重明显越低，田间调查蛀荚率和虫食率也越低。目前，蛋白酶抑制剂的抗虫作用已被很多研究所证实，且抗虫活性的强弱与抑制剂的种类、浓度及酶与抑制剂的比例等有关(Broadway, 1989)，在害虫防治中已显示出一定的应用潜力(于飞等, 2004; Tamhaneetal., 2007; 俞红恩和康玉凡, 2017; 张娴等, 2018)。特别是在抗虫基因工程中，如Hilder等(1987)将豇豆胰蛋白酶抑制剂基因转入烟草，获得高抗烟芽夜蛾Heliothisvirescens的转基因烟草，有效控制了烟芽夜蛾的为害。

我们的前期试验表明，取食感虫绿豆的绿豆象生长发育快，繁殖代数多，而取食抗虫绿豆的绿豆象幼虫发育不正常，甚至死亡(成小芳等, 2017)；且研究发现抗虫绿豆中胰蛋白酶抑制剂活性明显高于感虫绿豆(樊艳平等, 2017)。已有结果表明，蛋白酶抑制剂可以通过抑制昆虫幼虫体内蛋白酶活性从而影响鳞翅目或鞘翅目幼虫的生长发育以及存活(Gatehouse, 2011; de Sáetal., 2014; 张兵等, 2014; Zhu-Salzman and Zeng, 2015)。我们的前期试验也表明绿豆胰蛋白酶抑制剂(mung bean trypsin inhibitor, MBTI)对绿豆象幼虫体内蛋白酶活性如总蛋白酶、类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶活性均有一定影响(樊艳平等, 2018)，那么绿豆胰蛋白酶抑制剂对绿豆象生长发育及体内其他酶如解毒酶和保护酶活性的影响如何？为此，我们采用室内人工接虫和生物测定的方法，研究了抗虫绿豆中分离纯化获得的MBTI对绿豆象生长发育及幼虫体内解毒酶和保护酶活性的影响作用，为明确蛋白酶抑制剂对绿豆象幼虫的杀虫机理、合成含有该抑制剂的生物农药及蛋白酶抑制剂基因的利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试绿豆品种和试虫来源

感虫绿豆晋绿1号和抗虫绿豆B18均由山西省农业科学院作物研究所提供，供试昆虫为室内人工饲养多代的绿豆象C.chinensis幼虫，饲养条件为温度27±1℃、相对湿度60%～80%、光周期12L∶12D。试验在山西农业大学昆虫学重点实验室进行。

1.2 主要试剂和仪器

乙酸萘酯、毒扁豆碱均购自Sigma公司；SOD, POD, CAT和GST试剂盒均购自中国江苏南京建成生物研究所；考马斯亮蓝G-250购自北京中生瑞泰科技有限公司；标准分子量蛋白购自上海生物化学研究所；MBTI由本实验室采用盐析法、离子交换层析和亲和层析的的方法自抗虫绿豆B18提取纯化而来。

多功能食品粉碎机购自广东小熊电器有限公司；天平购自北京赛多利斯仪器系统有限公司；Centrifuge 5417R高速冷冻离心机购自德国Eppendorf公司；HR-215S海尔冰箱购自青岛海尔集团；Varioskan Flash酶标仪购自美国Thermofisher公司。

1.3 绿豆象生长发育指标测定

用多功能食品粉碎机将感虫绿豆晋绿1号粉碎并通过孔径140 μm筛，与抗虫绿豆胰蛋白酶抑制剂混合，配制成含有2.0% MBTI的人工绿豆，人工绿豆的制备方法参照Somta等(2006)的方法。取250粒人工种子，随机分为5组分别放入自制无盖小纸杯中，再将其置于带盖大纸盒内，将室内饲养羽化1～3 d的绿豆象成虫100对雌雄配对后接于大纸盒内，任其在供试绿豆上随机产卵，将着卵绿豆置于温度27±1℃、相对湿度60%～80%、光周期12L∶12D的人工培养箱中进行饲养，产卵5 d后，除去成虫，10 d后统计每组总着卵量和卵孵化率，最后取5组的平均值。21 d时观察是否有成虫出现，每12 h观察一次，同时记录羽化时间和数量，对4龄期幼虫进行称重，30 d后对成虫羽化率和幼期发育历期进行测定。以感虫绿豆晋绿1号磨碎后制成的人工绿豆作为对照，每处理3次重复，每重复40头幼虫。所观测的生长发育指标定义如下：

着卵量(number of eggs laid on beans)(N)：绿豆表面的总着卵数量。

卵孵化率(egg hatching rate)(%)：已孵化的卵数与总卵数的比值。

成虫羽化率(adult emergence rate)(%)：成虫羽化的数量与总卵数的比值。

幼期发育历期(d)(developmental duration of immature stages)：卵孵化到成虫羽化的时间。

1.4 绿豆象幼虫酶液制备

选用前述方法分别配制成含有0, 0.5%, 1.0%, 1.5%和2.0% MBTI 5个浓度梯度的人工绿豆，人工绿豆的制备方法参照Somta等(2006)的方法，绿豆象饲养方法同1.3节，并分别于1, 2, 3和4龄期对绿豆象幼虫体内解毒酶CarE和GSTs以及保护酶SOD, POD和CAT的活性进行测定，以感虫绿豆晋绿1号作为对照，每处理3次重复，每重复40头幼虫。

分别取各龄期绿豆象幼虫10 mg在预冷的0.15 mol/L NaCl溶液中清洗后，滤干水分，加入预冷的0.1 mol/L pH 7.0的磷酸缓冲液(精确量取十二水合磷酸氢二钠1.1098 g和二水合磷酸二氢钠0.2964 g加入50 mL容量瓶中，用纯化水定容至50 mL)100 μL冰浴上研磨，再加入上述磷酸缓冲液900 μL摇匀，4℃下10 000×g离心10 min，取上清液，即为测试用中肠酶液，置于冰箱保存备用，每处理3次重复(成小芳等, 2017)。

1.5 酶活性和蛋白质含量测定

CarE活性测定：参照van Asperen(1962)的方法，以α-乙酸萘酯(4×10-4mol/L)为底物，内含10-4mol/L毒扁豆碱，取400 μL上述底物加入1.0 mL 0.04 mol/L磷酸缓冲液(pH 7.0)和10 μL酶液混匀，于37℃下水浴30 min，加入DBLS显色剂使之呈现深蓝色，室温静置15 min，用酶标仪在600 nm处测吸光值，以不同浓度的α-萘酚作标准曲线。

GSTs活性测定：GST是通过检测还原型谷胱甘肽活性的高低反映GSTs活性的大小，使用可见分光光度法进行测定，具体操作步骤参照GST试剂盒说明书。

保护酶活性测定：SOD, POD和CAT活性的具体操作方法参照中国江苏南京建成生物试剂盒说明书进行。

以牛血清白蛋白(BSA)为标准蛋白，用Bradford(1976)方法测定，在595 nm处测得标准品和待测样品的吸光值，取3次重复的平均值，通过绘制标准曲线并查得待测样品中蛋白质含量。

1.6 数据分析

试验中生长发育指标以及解毒酶和保护酶活性测定均采取3次重复，以3次重复的平均值±标准差来表示。数据记录和处理由Softmax Pro 6.1软件进行，数据方差分析利用Excel 2007和SPSS 19.0软件进行数据统计和分析，处理与对照间的生长发育指标以t检验进行差异显著性检验，不同浓度MBTI对解毒酶和保护酶活性的影响以最小显著差异(LSD)法进行差异显著性检验。

2 结果

2.1 绿豆胰蛋白酶抑制剂对绿豆象生长发育的影响

由表1可知，绿豆象幼虫取食含2.0% MBTI的人工绿豆后，着卵量和卵孵化率均与对照无显著差异(P>0.05)，而幼虫体重和成虫羽化率均显著低于对照(P<0.05)，而幼期发育历期显著延长(P<0.05)，说明MBTI对幼虫体重、成虫羽化率和幼期发育历期影响较明显。其中幼虫体重和成虫羽化率分别只有对照的72%和55%，而幼期发育历期为对照的1.083倍。表明绿豆胰蛋白酶抑制剂对绿豆象幼虫体重、成虫羽化率和幼期发育历期均有一定影响。

表1 人工绿豆中2.0%绿豆胰蛋白酶抑制剂(MBTI)对绿豆象生长发育的影响

2.2 绿豆胰蛋白酶抑制剂对不同龄期绿豆象幼虫体内解毒酶活性的影响

由图1可知，绿豆象幼虫取食添加不同含量MBTI的人工绿豆后，幼虫体内CarE活性随龄期的增加逐渐增加，而GSTs活性随龄期的增加呈现先增加后降低的趋势，并于3龄期达到最高。取食不同含量MBTI对各龄期幼虫体内CarE和GSTs活性均有一定的促进作用，促进作用均随MBTI含量增加而逐渐增强，当取食MBTI含量为0.5%的绿豆后，各龄期体内CarE活性均与对照差异不显著(P>0.05)，说明较低的浓度对绿豆象幼虫CarE活性影响较小，当含量升高至1.5%时，各龄期幼虫体内CarE活性均与对照差异显著，当含量为2.0%时，CarE活性在各龄期均达最高，促进效果最强，均显著高于对照(P<0.05)，CarE活性在1, 2, 3和4龄幼虫期时分别比对照升高了46.5%, 32.6%, 28.6%和19.5%；而当幼虫取食1.0%～2.0% MBTI的人工绿豆后，各龄期幼虫体内GSTs活性均与对照差异显著(P<0.05)，当含量为2.0%时，GSTs活性在各龄幼虫期均达最高，促进效果最强，均显著高于对照(P<0.05)，GSTs活性在1, 2, 3和4龄幼虫期时分别比对照升高了60.5%, 37.2%, 33.6%和23.4%。表明绿豆象幼虫取食含MBTI的人工绿豆后，通过增加幼虫体内CarE和GSTs活性来对有害物质进行分解，从而减少有害物质对其体内造成的毒害作用。

从表2也可以看出，绿豆象不同龄期之间幼虫CarE和GSTs的活性均在α=0.01水平上差异显著，不同含量MBTI处理之间幼虫CarE和GSTs的活性也均在α=0.01水平上差异显著，而绿豆象龄期和MBTI处理的交互作用对幼虫GSTs活性在α=0.01水平上差异显著，而对CarE活性并没有显著影响(P>0.05)。

表2 不同龄期绿豆象幼虫体内解毒酶活性的方差分析结果

2.3 绿豆胰蛋白酶抑制剂对不同龄期绿豆象幼虫体内保护酶活性的影响

由图2可知，绿豆象幼虫取食添加不同含量MBTI的人工绿豆后，幼虫体内SOD和CAT活性均随龄期的增加逐渐增加，而POD活性随龄期的增加呈现先增加后降低的趋势，并于3龄幼虫期达到最高。取食MBTI含量不同的人工绿豆对各龄期幼虫体内SOD和CAT活性均有一定的抑制作用，抑制作用均随MBTI含量增加而逐渐增强，而取食不同含量MBTI对各龄期幼虫体内POD活性均有一定的促进作用，诱导作用均随MBTI含量增加而逐渐增强，当取食MBTI含量为1.0%～2.0%的绿豆后，各龄期幼虫体内SOD, POD和CAT活性均与对照差异显著(P<0.05)，当取食2.0% MBTI时，幼虫体内SOD和CAT活性在各龄期均达最低，抑制作用最强，其中SOD活性在1, 2, 3和4龄幼虫期分别比对照降低了69.8%, 75.0%, 78.0%和80.0%，CAT活性在1, 2, 3和4龄幼虫期时分别比对照降低了47.6%, 26.3%, 44.6%和35.0%，而当幼虫取食含2.0% MBTI的人工绿豆后，体内POD活性在各龄期均达最高，促进效果最强，POD酶活性在1, 2, 3和4龄幼虫期分别比对照升高了67.3%, 58.4%, 36.6%和35.0%。

图2 人工绿豆中不同浓度绿豆胰蛋白酶抑制剂(MBTI)对不同龄期绿豆象幼虫体内保护酶活性的影响

从表3也可以看出，绿豆象不同龄期之间幼虫SOD, POD和CAT的活性均在α=0.01水平上差异显著，不同含量MBTI处理之间幼虫SOD, POD和CAT的活性也均在α=0.01水平上差异显著，而绿豆象龄期和MBTI处理的交互作用对幼虫SOD活性在α=0.01水平上差异显著，对CAT活性在α=0.05水平上差异显著，而对POD活性没有显著影响。

表3 不同龄期绿豆象幼虫体内保护酶活性的方差分析结果

3 结论与讨论

研究表明，寄主植物对昆虫的生长发育、繁殖和种群增长有重要影响(王世贵等, 2008; Dengetal., 2013)，因此如果寄主植物成分适宜，幼虫取食后生长发育速度快，存活率高；反之，发育速度慢，存活率低(苏超等, 2013)。本研究结果表明，绿豆象幼虫取食含2.0% MBTI的人工绿豆后，幼虫体重和成虫羽化率分别只有对照的72%和55%，幼期发育历期为对照的1.083倍，而着卵量和卵孵化率并无显著变化(表1)，说明抗虫绿豆中含有不适宜绿豆象取食的物质，因而导致其幼虫生长发育受阻和羽化率下降，最终导致幼期发育历期也明显延长。

CarE和GSTs是昆虫体内分解有毒物质、维持正常生理代谢的重要酶系，在昆虫抵御不良环境胁迫中起着重要作用。当昆虫摄入有毒物质时，体内解毒酶活性会被迅速激活来对有毒物质进行代谢分解最终使昆虫存活下来。当绿豆象幼虫取食含MBTI的人工绿豆后，各龄期幼虫体内CarE和GSTs活性均有增加，且均随MBTI含量增加而逐渐增强，当取食MBTI含量较高(2.0%)的人工绿豆后各龄期幼虫体内CarE和GSTs活性均达最高，且均显著高于对照(图1)，表明MBTI对各龄期幼虫体内CarE和GSTs活性均有一定的促进效果，也表明绿豆象幼虫取食不适宜的物质后，需通过提高体内CarE和GSTs活性来分解有害物质对其体内造成的伤害而使绿豆象存活。此结果与斜纹夜蛾幼虫取食含大豆胰蛋白酶抑制剂的人工饲料后，生长延缓、体重减轻，且其中肠体内CarE和GSTs活性均有显著升高(吴国昭等, 2012, 2013)以及褐飞虱Nilaparvatalugens取食抗虫水稻后体内 CarE 活性显著高于取食感虫水稻(吕仲贤等, 1997)的研究结果相一致；也与棉铃虫取食含大豆胰蛋白酶抑制剂的人工饲料后，生长发育速度减慢，体重减轻(谢可方等, 2002)的研究结果相一致。

昆虫体内SOD, POD和CAT能够清除细胞内由于自由基累积产生的毒害，在昆虫体内的活性变化与外界刺激物的强度有关系(尹姣等, 2012)。正常情况下，这3种酶可以维持昆虫体内自由基的代谢平衡，但当遭遇病原物入侵或外源物质毒害后，体内自由基代谢就会发生异常，从而诱发脂质过氧化反应，并可能导致组织细胞发生氧应激性损伤(Ferrarietal., 2011; 刘建业等, 2014)。因此当昆虫取食含有抗虫成分的食物后，活性氧平衡就会受到破坏，同时活性氧累积，自由基浓度升高，最终导致昆虫生长发育受到影响(陈建明等, 2002; 李会平等, 2006)。取食含MBTI的人工绿豆对绿豆象各龄期幼虫体内SOD和CAT活性均有一定的抑制作用，抑制作用均随MBTI含量提高而逐渐增强，而对各龄期幼虫体内POD活性均有一定的促进作用，且促进作用也均随MBTI含量增加而逐渐增强，其中取食含量为2.0% MBTI的人工绿豆后，对各龄期幼虫体内SOD和CAT活性的抑制作用最强，以及对体内POD活性的促进效果最强(图2)。当绿豆象幼虫取食含有抗虫成分的食物后，体内POD活性显著升高，表明活性氧平衡受到破坏，幼虫体内氧自由基增多，因此虫体通过增加体内POD活性用以清除氧自由基的毒害。这与吴国昭等(2012)报道的斜纹夜蛾取食大豆胰蛋白酶抑制剂的人工饲料后，其体内的SOD, POD和CAT活性变化相一致，也与陈建明等(2002)报道的白背飞虱Sogatellafurcifera取食高抗水稻后其体内POD活性增强相一致，但其作用机制仍需进一步研究。