骤然低温下转录组测序揭示川百合抗寒通路与相关基因

摘要：在没有参考基因组的情况下，为了揭示川百合（Liliumdavidii）在4℃处理下基因表达谱的变化，为百合抗寒育种、引种及栽培提供理论支撑及技术支持。采用高通量IlluminaHiseq测序平台对川百合20℃（对照组）与4℃（处理组）温度条件下进行转录组测序，并对测序数据进行了分析研究，进一步探究川百合寒冷应答的分子机制。结果表明，经富集分析后得，与光合作用、光合作用-天线蛋白、光合生物体中的碳固定、叶绿素代谢等相关的基因可以作为研究川百合寒冷响应机制的主要研究对象。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析结果表明，随机选出的10个差异性表达基因的表达趋势与高通量测序结果一致。这为川百合响应低温相关基因的发掘与利用、川百合耐寒分子机制的揭示及百合种植资源遗传改良奠定了基础。

关键词：川百合;骤然低温;转录组;分子机制;抗寒通路

中图分类号：S644.101文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2020）22-0028-09

作者简介：田雪慧（1978—），女，陕西周至人，博士，副教授，主要从事花卉生产与应用方面的教学与科研工作。E-mail：txh_1214@163.com。

自然界中植物经常遭受干旱[1-4]、髙盐[5]、高温[6]和寒害[7-8]等生物或非生物胁迫，温度是影响植物生长发育与分布的主要决定性因素[9-11]，环境温度低于植物正常生长的温度会严重影响植物的产量和品质[12-14]，尤其是在早春和深秋时，温度突然降低会引起植物体内一系列变化。有学者报道称在许多植物中已经观察到其对低温胁迫的分子响应，包括基因表达[15]、氧化还原态[16]和复杂的信号转导[17-18]。但有关低温对百合影响的研究大多集中在百合鳞茎采收后休眠生理（春化）期的低温需求，而对其营养生长期的研究较少[8，19-20]。营养生长是百合鳞茎生长糖分积累的关键，因此研究冷胁迫对营养生长的影响具有重要意义。

转录组测序作为现代遗传学研究工具，功能强大、广受欢迎，在动植物中被广泛地应用于分析生物体在特定生物学过程中mRNA表达，揭示其内在的分子机制[21-22]。到目前为止，人们对许多植物的低温胁迫转录反应进行了大量的研究，包括卷单百合[4]、铁炮百合[23]等。这些研究已经发现了大量参与适应低温变化的冷应激相关基因[24]。然而，对食用百合研究较少，特别是川百合（LiliumdavidiiDuchartreexElwes）的研究至今还是空白。

[JP2]百合是一种药食同源植物，也是著名的观赏植物，具有很高的经济价值。川百合是一个优良的食用百合品种，生长在甘肃省兰州市七里河区，海拔超过2000m，白天的平均最高温度低于4℃，川百合耐寒性明顯高于其他食用百合品种[23]。因此，揭示川百合抗寒的分子机制具有重要意义，可为食用百合的高质量生产栽培及遗传育种提供依据。本研究以川百合为材料，以常温（20℃）为对照，低温（4℃）条件下进行转录组测序，目的是（1）根据基因本体论和京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析，探讨低温反应最丰富的通路;（2）鉴定光合作用及抗氧化相关基因。研究川百合抗寒的分子机制，有助于进一步了解食用百合是如何适应或不能适应环境变化的。

1材料与方法

1.1试验材料

收集甘肃省兰州市七里河区室外生长的成熟百合鳞茎，在2℃冰箱中保存110d。春化后，将鳞茎移栽于体积为2L直径为15cm的花盆中，置于（20℃）人工智能气候箱中。生长环境温度设置为白天20℃、夜晚15℃，相对空气湿度为50%～65%，光—暗周期为16h—8h，平均光照度为（350±20）μmol/（m2·s），每3～5d浇灌300mL水，用霍格兰（Hoagland）营养液为其提供充足养分。

1.2低温胁迫处理

将长势良好高度约15cm的川百合幼苗，在2个人工智能气候箱作不同温度处理（每室12株）。一室为对照，温度设为20℃，另一室为低温处理，温度设为4℃，其他环境参数与前处理相同。处理24h后取相同部位的叶片，液氮速冻，-80℃保存。

1.3指标测定

1.3.1转录测序

每室各取3份川百合叶片样品，采用TRIzol法提取总RNA[25]，并对其纯度、完整性、浓度等进行检测，检测合格的样品用磁珠富集mRNA[25]，再将mRNA打成短片段后合成第二链cDNA，修复、纯化、选择片段大小，然后进行聚合酶链式反应（PCR）扩增，纯化PCR产物，得到最终文库。高通量测序平台选用Illumina4000[25]，测序所得的数据称为rawreads或rawdata。对结果进行组装、拼接，并进行功能注释和表达水平分析。

1.3.2PCR验证

以川百合叶片RNA为材料，采用HiScriptⅡQRTSuperMixforqPCR试剂盒反转录合成cDNA，设计引物（表1）进行实时定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）分析，以Actin基因作为内参[26]，随机选取10个差异基因进行验证。

1.4数据分析

转录组数据由北京奥维森基因科技有限公司进行分析。

2结果与分析

2.1测序结果与Trinity拼接

由表2可知，对照组产生了868404526个原始序列，84782272个纯净序列，碱基含量为44.84%;处理组产生了74630164个原始序列，72715608个纯净序列，碱基含量为50.03%。这些结果表明川百合的转录组测序质量较高，可进行后续研究。

由表3可知，转录本共产生168637667个碱基，共产生133179110个单基因序列（约为转录本的79%）。单基因序列值高达转录序列的90%以上（核苷酸总数除外）。说明拼接良好，RNA质量较好，可进行后续分析。

2.2基因功能注释结果

如表4所示，所有基因中，有238301个基因被注释到相应的7个数据库中。其中，约27.41%的基因（65314个基因）被注释到NR库（NCBI蛋白质非冗余数据库），17.68%的基因（42138个基因）被注释到COG/KOG库（真核生物的同源基因数据库），14.79%的基因（35244个基因）被注释到GO库，15.91%的基因（37916个基因）被注释到Nt库（[CM（21*3]核酸序列数据库），19.44%的基因（46337个基因）被注释到Swiss-Prot，24.59%的基因（58605个基因）被注释到包含了（数据库）的蛋白质家族。其他无法注释到数据库中的基因可能是由于基因片段过短或数据库中信息缺乏等原因。

将GO、KEGG、KOG中注释的基因进行分类，评价组装后基因的功能（图1）。GO分类中，将基因分为生物过程、细胞组分和分子功能3组，在分子功能中，“结合活性（binding）”和“催化活性（catalyticactivity）”的基团最多（图1-a）;为了进行KOG函数的分类，将所有基因分类为26个亚类，“一般功能预测（generalfunctionpredictiononly）”的聚类最多（图1-b）;KEGG分类中，5组基因均有表达，代谢组中，“全球概览图（globalandoverviewmaps）”“转录（Translation）”和“碳水化合物代谢（Carbohydratemetabolism）”的聚类显著丰富，分别有1730、1592、1127个基因（图1-c）。结果表明，低温诱导了一系列涉及生物过程、细胞组分、分子功能、代谢等不同亚类的单基因显著富集。

2.3基因表达差异分析

2.3.1GO富集分析

将所有差异基因进行GO富集分析后，上调基因富集结果如图2所示，在细胞组分中，富集效果较明显的功能有细胞膜、细胞器、细胞核;分子功能中富集效果较明显的功能有蛋白激酶活性、磷酸转移酶活性、激酶活性;生物过程中富集效果较明显的功能有磷代谢过程、复合磷酸盐代谢过程、磷酸化作用、蛋白磷酸化。结果表明上调差异基因在细胞成分、分子功能、生物过程等3个方面主要调节物质的合成代谢。

下调基因富集分析结果如图3所示，细胞成分功能中富集较为明显的是光系统Ⅰ和光系统Ⅰ反应中心;分子功能中富集较为明显的是水解酶活性、电子运输活动等。生物过程功能中富集较为明显的是光合作用、光反应等。因此，下调基因在细胞组分、分子功能、生物过程3个方面主要调节光合作用。

2.3.2KEGG富集分析分析结果如图4所示，上调差异基因显著富集的通路有植物生理节律（circadianrhythm-plant），苯丙氨酸代謝（phenylalaninemetabolism），真核生物核糖体生物合成（ribosomebiogenesisineukaryotes），甘氨酸、苏氨酸、丝氨酸和β-氨基酸代谢（glycine，serineandthreoninemetabolism），黄酮类化合物（flavonoidbiosynthesis）、氨基酸类的生物合成（biosynthesisofaminoacids），植物激素信号转导（planthormonesignaltransduction）等。上调差异基因c168304_g1、c148234_g1、c168304_g3、c168304_g2、c166080_g1（EC：4.3.1.24）、c165806_g1（EC：1.14.13.11）等主要调节氨基酸代谢;c169999_g5（pseudo-responseregulator5）、c174283_g3等主要调节植物生理节律;c152959_g1和c146280_g1（EC：5.4.9.9）主要调节真核生物核糖体合成;c151401_g1、c146896_g1、c146896_g3、c174513_g3、c174513_g1、c155146_g1和c169857_g1（EC：2.3.1.74）主要调节黄酮类化合物的合成;c163360_g1主要调节植物信号转导。

下调基因显著富集的通路有光合作用、光合作用[CM（21]-天线蛋白、卟啉和叶绿素代谢、光合生物碳固定等（如图5所示）。下调基因c198283_g1和c153649_g1主要调节光反应系统，c149445_g1、c115377_g1、c167947_g1和c170780_g1（EC：1.2.1.70）主要调节叶绿素代谢，c169641_g1（EC：1.1.1.37）主要调节碳固定。因此，下调基因通过调节光反应系统和叶绿素的合成，从而调节光合作用。

2.4qRT-PCR验证

为验证测序结果的可信度，随机选取10个差异基因，其中5个上调基因（c111268_g1、c145664_g1、c145507_g1、c128115_g1），5个下调基因（c117236_g1、c119413_g2、c135104_g1、c93924_g1），以Actin为内参进行PCR验证。由图6可知，10个基因在不同温度下的表达程度不同，但表达趋势与高通量测序结果一致，则表明测序结果真实可靠。

3讨论与结论

冷胁迫指植物暴露在较低但不结冰的温度下而导致的损伤[26]，生长期间突然出现的低温严重影响百合的生长。本研究对川百合抗寒性相关的关键基因进行筛选和验证，可以为川百合简单重复序列标记（SSR）的开发和分子育种提供参考。

之前的研究表明，低温胁迫引起百合幼苗体内生理生化水平发生了巨大的变化[18]，表明川百合在其营养生长早期对4℃低温较为敏感。本研究比较了川百合在常温和低温下的代谢情况，阐明了川百合具有独特的抗寒机制。冷应激诱导丰富度的结果（图3）表明，它可能导致分子水平上的许多代谢过程，从而提供低温胁迫条件下可能的分子机制。

将基因分为GO、KEGG、KOG等不同类别（图2），在分子功能方面，发现“结合活性（binding）”和“催化活性（catalyticcativity）”是最常见的2个基团（图2-a），这些基因包括结构分子活性和转运体活性的形成[27]，影响植物的代谢过程。同时还发现，在代谢组KEGG数据库，碳水化合物代谢、维生素代谢、能量代谢等代谢通路的差异表达基因最丰富[CM（21]，人们普遍认为，这些通路是抑制其生长和发育的内在代谢通路。从整体上看，KEGG数据库中响应低温胁迫的基因非常丰富，[JP3]须要深入挖掘其分子机制。

基于GO和KEGG分析的低温与常温下富集最丰富的通路分别如图4和图5所示，包括上调通路和下调通路。研究表明，细胞成分（胞内膜内和膜内细胞器）中与膜相关的通路显著上调（图4），膜对冷应激反应显著。此外，在GOterm的生物学过程中，磷酸化和蛋白磷酸化通路在低温胁迫下显著上调，这可能是因为磷是膜的重要成分，这与Moellering等的研究[28]相同。此外，叶片对水的响应和对非生物刺激的响应途径显著上调，因为低温下叶片的相对含水量会降低[29];与光合作用相关的通路（光合作用、光收获、光合作用、光反应）显著下调，与许多以前的报道和目前关于低温下光合作用响应的研究数据[30]一致。

为了验证RNA-seq数据的可靠性，随机选择了10个与光合作用、代谢途径、代谢途径和氧化磷酸化相关的基因，采用qRT-PCR方法检测其相对表达（图6）。结果与RNA-seq数据吻合较好，说明RNA-seq数据是可靠的，可以用来揭示川百合对低温反应的分子机制。

低温（4℃）胁迫显著降低了川百合细胞膜的稳定性。通过转录组分析，筛选出与抗寒性、光合作用、代谢途径等相关的关键基因，为川百合SSR的开发和分子育种提供了参考。川百合抗寒相关基因、代谢物及途径还有待进一步研究。

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