骨肉瘤的免疫检查点及其抑制剂应用的研究进展

赵迎春 冯 娥 田云云

(武汉大学人民医院骨科，湖北省武汉市 430060，电子邮箱：kh_zyc@163.com)

【提要】 骨肉瘤是骨骼最常见的原发性恶性肿瘤之一，目前治疗骨肉瘤的方法可用于约70%的患者，然而转移性或复发性骨肉瘤患者的生存率在过去30年中基本没有改变，亟须寻找新的治疗方法。肿瘤免疫治疗主要通过增强机体抗肿瘤免疫功能来抑制和杀伤肿瘤细胞，在各种肿瘤中已经显示出良好的临床结果，有望成为治疗骨肉瘤的新策略。本文对骨肉瘤中的免疫检查点及其抑制剂的应用进行综述，以期为骨肉瘤的防治研究提供思路。

骨肉瘤是骨骼最常见的原发性恶性肿瘤，好发于四肢长骨干骺端，具有易发生早期转移、病情进展快、预后差的特点[1]。在世界范围内其发病率约为百万分之三，易感人群为儿童和青少年[2]。目前，骨肉瘤的治疗方法包括外科保肢手术治疗、新辅助化疗、靶向治疗和免疫治疗等，尽管这些治疗手段能够治疗约70%的骨肉瘤患者[3]，但转移性或复发性骨肉瘤患者的生存率在过去30年中基本没有改变，这使得骨肉瘤治疗效果仍处于瓶颈期，亟须寻找新的治疗方法[4]。近年来，肿瘤免疫治疗备受学者们的关注。病理状态下，癌细胞能够发生免疫逃逸[5]。而肿瘤免疫治疗主要通过增强机体抗肿瘤免疫功能，抑制和杀伤肿瘤细胞。目前，肿瘤免疫治疗在多种肿瘤中显示出良好的临床效果，包括黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、膀胱癌和头颈癌[6]，然而针对骨肉瘤的研究尚少见。本文对骨肉瘤中的免疫检查点及其抑制剂应用于骨肉瘤治疗的研究进展综述如下。

1 骨肉瘤中的免疫检查点

1.1 程序性死亡受体-1/程序性死亡配体-1 目前已有许多学者检测了骨肉瘤细胞系和骨肉瘤组织中程序性死亡配体1(programmed cell death ligand 1,PD-L1)的表达量，结果显示虽然在骨肉瘤细胞系中的PD-L1表达量高低不一，但与亲代细胞系相比，PD-L1表达量越高则骨肉瘤耐药性越强[7-8]。基于此，学者们针对PD-L1开展了许多生物学研究，包括利用CRISPR/Cas9基因编辑系统靶向骨肉瘤细胞系中PD-L1基因的研究，结果表明PD-L1可调控骨肉瘤的生长及其对多比柔星和紫杉醇的耐药性[9-10]。研究显示，23.7%的人类骨肉瘤组织高表达PD-L1，50%的人类骨肉瘤组织表现出中等表达，并且PD-L1的表达量与转移和肿瘤浸润淋巴细胞相关[11]。一项Meta分析也表明，骨肉瘤组织中PD-L1表达量比其他肉瘤组织高14%～75%，且与肿瘤的转移、患者病死率、不良预后密切相关[12]。这说明PD-L1高表达可能是骨肉瘤患者的预后不良因素。

利用抗程序性死亡受体1(programmed cell death 1,PD-1)和抗PD-L1阻断疗法治疗骨肉瘤小鼠模型显示出良好的治疗效果，相较于对照组(采用生理盐水注射)而言，经抗PD-1抗体处理的骨肉瘤人源小鼠模型更不容易发生肺转移[13]。采用由抗PD-1、抗PD-L1和抗肿瘤坏死因子受体超家族成员4(CD134)组成的三联抗体治疗的移植骨肉瘤小鼠，生存时间显著延长，并且CT扫描和组织学随访结果显示50%小鼠未发生肺转移[7]。以上研究结果提示抗PD-1和抗PD-L1阻断疗法治疗骨肉瘤具有显著的效果，这给晚期骨肉瘤患者带来了希望。

1.2 细胞毒性T细胞相关抗原4 细胞毒性T细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4，CTLA-4)，即CD125，是在T淋巴细胞表面上表达的蛋白质受体，在T细胞活化期起着关键作用。正常情况下，为了减轻过度活化免疫应答，当抗原呈递细胞上的主要组织相容性复合体Ⅰ类或Ⅱ类抗原呈递给T细胞受体时，T细胞开始活化，并以CD28[T细胞与肿瘤细胞或抗原呈递细胞上的B7-1(CD80)或B7-2(CD86)结合]形式的共刺激信号扩增[14]。T细胞活化以后，CTLA-4可能从细胞内区域转运到T细胞表面，以比CD28更大的亲和力结合B7-1和B7-2，进而下调免疫应答，达到外周免疫耐受[15-16]。

CTLA-4抑制信号非常复杂，它们还可以抑制T细胞内白细胞介素-2转录、抑制含有Src同源结构域的酪氨酸磷酸酶表达，以及抑制B7-1和B7-2的反式内吞作用[15]。CTLA-4也在调节性T淋巴细胞上表达，控制效应T淋巴细胞的功能并促进免疫耐受。研究表明，阻断CTLA-4受体会增加CD8+肿瘤浸润淋巴细胞的活化并减弱T淋巴细胞活性[16]。Leach等[17]的研究表明，在结肠癌或纤维肉瘤的小鼠模型中，抗CTLA-4抗体与肿瘤溶解物负载的树突状细胞相结合，可增强CD8+肿瘤浸润淋巴细胞的活化并降低T淋巴细胞表达，从而抑制肿瘤转移和延长小鼠存活时间。目前为止，抗CTLA-4阻断疗法已成功用于治疗晚期黑色素瘤和其他肿瘤，如非小细胞肺癌、肾细胞癌和前列腺癌[6]。另外有研究显示，人单克隆IgG1抗CTLA-4抗体(也称为伊匹单抗)能够显著延长转移性黑素瘤患者的中位总生存期[18]。基于此突破性的研究结果，学者们正在探索CTLA-4对其他实体瘤的潜在作用，包括骨肉瘤。一项使用伊匹单抗治疗儿童晚期实体肿瘤的Ⅰ期临床试验表明，33例患儿中有6例病情进展稳定，其中8例骨肉瘤患儿中有2例发生免疫相关不良事件，但其预后尚可；然而，发生免疫相关不良事件的患儿其总生存期长于没有发生免疫相关不良事件的患儿[19]。

1.3 B7同源物3 B7同源物3(B7 homology 3，B7-H3)，即CD276，是B7-CD28家族的抑制蛋白，在抑制T细胞活化、增殖和产生细胞因子中起重要作用。B7-H3在其他免疫细胞中也有表达，包括抗原提呈细胞、自然杀伤细胞和B淋巴细胞。多种肿瘤均存在B7-H3过表达现象，如黑素瘤、非小细胞肺癌、骨肉瘤和横纹肌肉瘤[20-21]。有学者报告[22]，91.8%的骨肉瘤组织中表达B7-H3，其表达量显著高于邻近的健康组织、骨软骨瘤和纤维异常增生组织；另外，B7-H3表达水平与浸润肿瘤的淋巴细胞数量呈负相关，可促进骨肉瘤细胞侵袭，且高表达B7-H3的骨肉瘤患者存活和复发时间短于低表达的患者。

鉴于以上研究成果，目前开展了许多针对抗B7-H3抗体功效的研究。Enoblituzumab是一种人源IgG1单克隆拮抗剂B7-H3抗体，已被用于治疗B7-H3表达阳性的难治性肿瘤患者，如黑色素瘤和晚期实体肿瘤，结果显示患者病情稳定(至少12周)且2%～69%的肿瘤体积缩小，具有良好的耐受性且没有剂量依赖性毒性[22]。MGD-009是一种人源双重亲和力和重新靶向蛋白，可与T细胞上的CD3及其靶细胞上的B7-H3结合，其已进入Ⅰ期临床试验，该药主要针对间皮瘤、黑色素瘤、小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌或软组织肉瘤患者[7]。

1.4 自然杀伤细胞激活受体组2成员D及其相关配体 自然杀伤细胞激活受体组2成员D(natural killer cell group 2 member D，NKG2D)及其配体(natural killer cell group 2 member D ligand，NKG2DL)在先天免疫中起关键作用。从功能上讲，NKG2D是属于CD94/NKG2家族的共刺激跨膜蛋白受体，存在于CD8+T淋巴细胞、γδ T细胞和活化的巨噬细胞中。NKG2DL主要在感染和恶性转化情况下表达上调，很少在正常细胞中表达。在细胞水平上，NKG2D/NKG2DL的结合，通过磷脂酰肌醇-3激酶和生长因子受体结合蛋白2-鸟嘌呤核苷酸交换因子1途径，触发自然杀伤细胞活化，导致细胞毒性颗粒释放，最终导致肿瘤细胞凋亡，属于一种保护机制，而晚期癌细胞可以通过下调或脱落NKG2DL来逃避免疫监视[24]。NKG2DL表达、其下游通路和自然杀伤细胞的细胞毒性有望成为癌症研究的新领域。

研究显示，在22个骨肉瘤细胞系中，NKG2DL呈中等至高水平表达，其中14个原发性骨肉瘤细胞系都对由自然杀伤细胞介导的NKG2D/NKG2DL相互作用诱导的细胞毒性敏感，然而NKG2DL的高表达与敏感性增加无相关性；该研究还表明，螺内酯可上调原发性骨肉瘤细胞系中NKG2DL的表达，并显著增强肿瘤细胞对自然杀伤细胞介导的NKG2D/NKG2DL相互作用诱导的细胞毒性的敏感性[25]。另一项研究显示，NKG2D-嵌合抗原受体阳性(chimeric antigen receptor positive，CAR+)T淋巴细胞在体外和小鼠骨肉瘤中对骨肉瘤细胞系的细胞溶解活性显著增加，同时保留了健康细胞[26]。此外，有研究显示，采用γδT细胞免疫治疗结合DNA去甲基化药物地西他滨治疗骨肉瘤的效果良好，因为地西他滨增强了骨肉瘤细胞中NKG2DL表达，从而增强了骨肉瘤细胞对细胞毒性γδT细胞的易感性[27]。还有学者发现，14种不同的骨尤文肉瘤细胞系广泛表达NKG2DL，使用慢病毒将CD3ζ/CD28衍生的信号传导结构域与NKG2D融合后，可以产生能够引起骨尤文肉瘤细胞死亡的NKG2D-CAR+T淋巴细胞[28]。

1.5 人类白细胞抗原G 人类白细胞抗原G(human leukocyte antigen G，HLA-G)在调节免疫应答中具有重要作用。 HLA-G对自然杀伤细胞和T细胞的免疫应答具有抑制作用，并且在间充质基质细胞、T淋巴细胞和各种癌症细胞中均有表达。研究显示，在34.0%的骨尤文肉瘤活组织中检测到HLA-G的表达，虽然HLA-G的表达与肿瘤浸润淋巴细胞增加密切相关，但与其他临床参数无关[29]。因此，调节肿瘤微环境中的HLA-G表达可能会减弱肿瘤细胞对自然杀伤细胞的抵抗力，从而提高骨尤文肉瘤免疫治疗的效果。

2 骨肉瘤中的联合免疫治疗

2.1 PD-1和CTLA-4联合阻滞疗法 免疫检查点阻滞免疫疗法的理想效果是对当前治疗方法无反应的患者实现长期疾病控制，而联合阻滞治疗是针对机体在可耐受的毒性作用下提高疗效的一种新治疗方案。Postow等[30]联合应用伊匹单抗和纳武单抗治疗142例未接受治疗的黑色素瘤晚期患者，结果显示联合治疗组的总体有效率为61%，而单独使用伊匹单抗组的总体有效率为11%，其中两组的完全反应比例为0.22 ∶0。基于此试验结果，美国食品药品监督管理局已经批准了这两种药物联合治疗晚期黑色素瘤，并促进了该疗法用于治疗其他肿瘤的研究，例如骨肉瘤。

有学者使用抗PD-L1与抗CTLA-4抗体联合治疗骨肉瘤小鼠，结果显示所有小鼠未发生骨肉瘤转移，其中60%的小鼠长期无病存活，而接受抗PD-L1阻滞单药治疗的小鼠并没有实现长期无病生存，这表明联合阻滞疗法具有明显优势[31]。一项针对转移性骨肉瘤患者的Ⅱ期临床试验研究显示，单独使用纳武单抗组的确诊反应率为5%，伊匹单抗与纳武单抗联合治疗组为16%；联合治疗组的中位无进展生存期和总生存期分别为4.1个月和14.3个月，优于单独使用纳武单抗组的1.7个月和10.7个月；单独使用纳武单抗组、联合治疗组中分别有19%、26%的患者发生了严重的免疫相关不良事件，但两组均未发生与治疗相关的死亡[7]。这项临床试验证实了联合治疗具有显著疗效且安全性可控。

2.2 免疫检查点阻滞和放射治疗联合疗法 目前放射治疗被认为是单纯局部抑制肿瘤的经典手段，单独使用放射治疗可以增强全身免疫反应并减少远处转移的发生，即“远隔效应”。这种抗肿瘤免疫反应很大程度上是由CD4+和CD8+T淋巴细胞反应增强以及免疫检查点阻滞反应增强所引起。因此，放射治疗联合免疫检查点阻滞疗法或可更好地改善肿瘤患者的临床结局，且已在骨肉瘤并发微转移的患者中得到了证实[32-33]。

已有临床试验正在积极研究免疫检查点阻滞(特别是PD-1、PD-L1和CTLA-4)联合放疗治疗各种肿瘤患者，例如晚期黑色素瘤、非小细胞肺癌、头颈癌、肝癌、前列腺癌和淋巴瘤[34]。但是还没有临床试验显示在未接受过治疗的肿瘤患者中，免疫检查点阻滞治疗联合放疗优于任一单纯疗法，并且这种联合治疗方案所招募的骨肉瘤志愿者很少。目前有一项正在进行的Ⅰ期临床试验比较了纳武单抗和定向放射联合治疗与单独使用纳武单抗治疗晚期脊索瘤的效果，然而该试验仍处于研究阶段，尚未公布任何结果。

2.3 免疫检查点阻滞联合靶向治疗或化疗疗法 目前联合免疫检查点阻滞治疗、化疗或靶向治疗的研究已经扩展到软组织肉瘤，然而这些联合疗法对于骨肉瘤的研究相对较少。一项回顾性研究显示，纳武单抗联合帕唑帕尼(酪氨酸激酶血管内皮生长因子抑制剂)治疗28例软组织肉瘤或骨肉瘤患者，其中包括4例骨肉瘤患者，在治疗超过4个周期后，一半的患者临床受益[35]。

3 展 望

免疫检查点抑制剂因其在骨肉瘤治疗中的潜在作用而引起学者们的广泛关注，并且随着临床试验的开展，免疫检查点抑制剂仍会成为长期的研究方向。目前，研究表明骨肉瘤患者中PD-1和PD-L1的表达水平差异较大，并且与预后呈负相关[36]。然而，根据PD-1和PD-L1的表达水平尚不能可靠地预测患者对治疗的反应。与单一免疫检查点阻滞治疗相比，联合其他疗法的免疫检查点阻滞治疗方案已显示出优越的临床效果。因此有必要找到合适的联合阻滞剂药物，既保证免疫相关不良事件在骨肉瘤患者的可承受范围内，又具有最大的临床效益，这将是未来的研究新领域。