Dock2调节免疫细胞功能的研究进展

吉卢琳，陈玲霞，谢 璐，刘雨霞，刘志平，

（1.赣南医学院2018级硕士研究生；2.赣南医学院基础医学院；3.赣南医学院炎症与免疫中心，江西 赣州341000）

免疫系统通过先天性免疫细胞识别外来病原或内在危险信号，之后与后天性免疫细胞之间的相互协同来对抗感染及自身免疫疾病。免疫细胞在体内分布很广泛，种类众多，包括先天性免疫细胞如单核巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞等和后天性免疫细胞如T、B淋巴细胞。细胞分裂贡献者2（Dedicator of cytokinesis 2，Dock2）是介导GTP-GDP交换而特异性激活小G蛋白Rac1的鸟嘌呤交换因子（Guanine nucleotide exchange factors，GEFs）［1］，主要表达于免疫细胞，调节肌动蛋白和细胞骨架，介导细胞粘附和迁移［2］。Dock2作为免疫细胞的调控分子，对其发育、活化、增殖、迁移和效应等功能起着十分重要的作用。本文就Dock2的结构及其在各种免疫细胞的功能的最新进展作一综述。

1 Dock2的结构

Dock2最初被描述为KIAA0209，为编码CDM家族蛋白的一个成员，是哺乳动物里鉴定的第二个Dock蛋白，属于Dock家族，在免疫细胞中特异性表达［3］。Dock家族包括Dock1至Dock11共11个家族成员，基于序列和结构域相似性，分为四个子系列Dock A、B、C、D，而Dock1、Dock2、Dock5同属于Dock-A亚家族［1］。Dock家族在进化过程上十分保守，最大的特征是具有Dock同源区-1（Dock homology region-1，DHR1）和DHR2两个结构域。DHR1结构域含有200～250个氨基酸并且能够结合磷脂酰肌醇3、4、5-三磷酸腺苷（Phosphatidylinositol 3，4，5-triphosphate，PIP3），而PIP3是磷脂酰肌醇3-激酶（Phosphatidylinositide 3-kinase，PI3K）的脂质产物［1］。当PIP3或PI3Ks缺失时，Rac的激活减弱［4-5］。DHR2结构域含有450～550个氨基酸并具有GEFs活性，能够介导GTP-GDP交换而特异性激活小G蛋白Rac，调节细胞骨架的形成。Dock2的丝氨酸同源区3（Src homology 3，SH3）含有50个氨基酸和具有结合吞噬细胞运动蛋白1（Engulfment and cell motility 1，Elmo1）的能力。Elmo1存在于细胞内囊泡中，是一种胞质衔接蛋白，可与Dock家族GEFs相互作用，从而促进小GTPase Rac的活化［6-7］。SH3和Elmo1结合能够抑制Dock2的泛素化防止Dock2降解，促进DHR2与Rac结合而激活Rac［2］。此外，Dock2通过其C端多碱基氨基酸区（C-terminal polybasic amino acid Region，PBR）与细胞膜成份磷脂酸（Phosphatidic acid，PA）结合［4，8］，促进细胞趋化功能［9］。

2 Dock2对淋巴细胞的作用

2.1 Dock2调控淋巴细胞的转运和归巢淋巴细胞的转运参与维持机体的免疫功能的稳态，是诱导适应性免疫应答的关键。幼稚淋巴细胞通过次级淋巴组织（例如淋巴结，Peyer′s淋巴结和脾脏）的再循环过程从而发挥正常的免疫功能［10］。T细胞和B细胞受趋化因子［C-X-C motif chemokine 13（CXCL13）、C-C motif ligand 19（CCL19）和C-C motif ligand 21（CCL21）］的调控通过血液循环进入次级淋巴器官，在次级淋巴组织中遇到抗原后，大多数的淋巴细胞可以迁移到淋巴外组织发挥功能［11］。因此，淋巴细胞的转运对于机体诱导适应性免疫反应十分重要。淋巴细胞运输的精确特异性依赖于某些趋化因子的特异性信号，淋巴细胞从骨髓或胸腺向外周淋巴器官迁移是由趋化因子如C-X-C motif chemokine 12（CXCL12）、CXCL13、和CCL21驱动的，而淋巴细胞从外周淋巴器官向感染部位迁移是由1-磷酸神经鞘氨醇（Sphingosine-1-phosphate，S1P）介导的［12-13］。有研究显示，野生型（Wild-type，WT）淋巴细胞在体外用CCL21和CXCL13刺激时，激活Rac以剂量依赖的方式有效迁移。然而，Dock2-/-淋巴细胞对这些趋化因子没有表现出任何迁移有关的反应，这些趋化因子包括基质细胞衍生因子-1（Stromal cell derived factor，SDF-1）（T和B细 胞）、CXCL13（B细胞）和CCL21（T细胞），导致T细胞和B细胞在次级淋巴器官的归巢受到损害以及次级淋巴 器 官 的 严 重 萎 缩［13-14］。WT的T细 胞 通 过CCL21-Dock2-Rac-F-actin通路调控趋化因子信号通路，然而Dock2缺陷导致Rac表达减少，F-actin聚合下降，影响细胞骨架重排和形状改变。此外，Dock2-/-小鼠的脾脏和淋巴结中的淋巴细胞数量和百分比相比于WT小鼠显著下降［15-16］。

Dock2还被认为参与了化学激酶介导的整合素激活，虽然Dock2-/-T细胞在整合素依赖的黏附没有受到影响，但是B细胞的整合素激活受到损伤，这也导致整合素诱导的B细胞迁移显著减少［15］，说明T细胞和B细胞在趋化因子诱导的整合素激活中存在不同通路［15］。

因此，Dock2蛋白通过激活Rac调节肌动蛋白的细胞骨架、细胞粘附和迁移，在淋巴细胞转运和归巢过程中起着关键作用，然而，对于Dock2受各种因素调节和其参与的具体机制还缺乏系统的认识。

2.2 Dock2促进T淋巴细胞免疫突触形成、增殖、活化淋巴细胞的肌动蛋白骨架是免疫突触的形成和成熟，以及它的信号传递和细胞活性的重要中介［17］。免疫突触是在T细胞和抗原递呈细胞（Antigen presenting cells，APC）之间的免疫应答分子的相互作用形成的界面，一旦相互作用被破坏，宿主可能发生肿瘤/病原体逃逸或受到自身免疫反应的攻击［18］。研究发现小鼠脾或胸腺通过TCR-Rac-Dock2通路调节T细胞［19］。此外，Dock2-/-T细胞与APC之间的界面形成，以及定位于界面上抗原诱导的TCR转位和脂筏形成相比于Dock2+/-都严重受损，导致抗原特异性T细胞增殖显著下降［19］。因此，Dock2通过调控TCR信号通路下游Rac的激活，重塑肌动蛋白骨架，促进T细胞的活化和分化。最新的研究发现2名Dock2-/-患者的T细胞基础和最大线粒体耗氧量下降，提示线粒体功能缺陷。其T细胞受体（T cell receptor，TCR）受到刺激后，细胞增殖反应也受损［20］。这显示，Dock2可通过激活Rac维持线粒体功能的完整性促进T细胞的活化［20］。因此，Dock2蛋白通过激活Rac调节T淋巴细胞免疫突触的形成、增殖和活化，使淋巴细胞在适应性免疫中发挥正常的功能。

2.3 Dock2是CD8+虚拟记忆T细胞的负调控因子Dock2不仅调节T细胞迁移、发育、增殖、活化，而且还调控CD8+T记忆细胞的正常功能。CD8+T细胞在适应性免疫应答反应中起着关键的效应，T细胞反应的主要特征之一是建立长寿命的记忆细胞，这些细胞在病原体再次暴露时迅速作出反应，在防止病毒等细胞内病原体的感染和再感染中起重要的作用［20］。传统上，免疫记忆是抗原特异性的，但免疫记忆的机制可以被先天或不接触抗原的免疫细胞所利用。虚拟记忆T细胞是其中一种未接触外来抗原的T细胞，并且具有获得记忆样的表型，可以通过降低信号的临界值提前进入细胞周期或调节它的效应功能［21］。由于虚拟记忆T细胞表现天然免疫的特性，并分泌细胞因子从而提供旁观者保护性免疫，因此通常被认为是有益的［22］。虚拟记忆细胞参与细胞内细菌感染的抵抗，研究发现Dock2功能缺陷小鼠的虚拟记忆CD8+T细胞的表达与对李斯特菌抵抗力增加相关联，在感染3天后分泌较多的IFN-γ抵抗胞内菌感染［23］。此外，淋巴细胞向记忆的转化与T细胞接收到的紧张性自身肽信号的强度有直接的联系。虽然Dock2可能促进TCR对强激动剂的反应，但Dock2缺失的CD8+T细胞对弱激动剂的反应增强［23］。Dock2的缺陷使进入虚拟记忆腔室的细胞对自身抗原亲和阈值降低，导致幼稚T淋巴细胞直接向虚拟记忆T细胞的转化增强［23］。总之，Dock2可能是通过控制对弱激动剂的反应阈值从而抑制CD8+虚拟记忆T细胞的生成，也揭示了Dock2对CD8+T虚拟记忆细胞的负性调控作用。

2.4 Dock2促进B淋巴细胞免疫突触形成、增殖、活化Dock2还调控B淋巴细胞的免疫细突触形成以及B淋巴细胞的发育、增殖和活化。由于PI3K和磷酸酶基因（Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）蛋白共同维持PIP3的产生，而PIP3与Dock2结合激活Rac促进F-actin重塑使BCR微簇持续生长，促进免疫突触的形成［24］。与此一致，Dock2的缺陷显著破坏B细胞免疫突触的结构。体外刺激B细胞或者B细胞过继性转移证明B细胞通过Dock2-Rac轴介导BCR信号，促进免疫突触的形成以及浆细胞分化。同时，Dock2-/-的浆细胞分化相对于WT浆细胞严重受损［25］。在B细胞特异性敲除Dock2的小鼠的血清IgG1和IgG2b水平比对照小鼠显著降低，特异性IgG抗体的产生也严重受损［25］。因此，Dock2通过激活Rac调控B淋巴细胞的发育和活化。有趣的是，另外一个研究证明WT小鼠的边缘区B（Marginal zone B，MZB）细胞是通过Dock2-pWASP-F-actin促进BCR微簇的持续生长［26］。此外，我们最近的研究发现，Dock2-/-小鼠的MZB细胞数量相对于C57BL/6J小鼠显著下降，这是由于Dock2的缺失导致CD21蛋白的下降，使得CD21和CD19介导的BCR信号下调以及B细胞早期活化的减少［26］。因此，Dock2对B淋巴细胞的免疫突触形成、发育、活化至关重要。

3 Dock2调节NK细胞的细胞毒性、脱颗粒、IFN-γ产生和NKT细胞的发育

Dock2还调节NK细胞和NKT细胞的功能。NK细胞是先天免疫细胞，不仅在抗肿瘤、病毒感染时发挥作用，还能通过分泌细胞因子或趋化因子促进或抑制其他免疫细胞发挥功能，其过度活化或功能障碍可能与某些疾病的发病机制有关［27］。NK细胞表达的NKG2D（Natural killer group 2 member D）受体能够识别内源性主要组织相容性复合体（The major histocompatibility complex，MHC）Ⅰ类相关分子，诱导受体在界面处聚集，通过重塑肌动蛋白细胞骨架诱导突触的形成，调节细胞溶解效应分子（如穿孔素和颗粒酶）的分泌［28-30］。有研究发现，与WT小鼠相比，Dock2-/-小鼠NK细胞的细胞毒性和IFN-γ的分泌显著减少［31］。虽然Dock2-/-NK细胞在体外可以与靶细胞结合，但不能有效杀伤白血病细胞，对MHC-I缺乏的骨髓细胞也无法起到作用。PI3K活性是NK细胞介导的细胞毒性和突触形成所必需的。研究发现，NKG2D的刺激诱导PIP3的积累，Dock2通过DHR-1域与PIP3结合，因此，Dock2可能是通过DHR-1域与PIP3的相互作用转移到突触上的，通过NKG2D介导Rac激活途径调控NK细胞的细胞毒性功能和IFN-γ的分泌［31］。一例罕见IgM显著升高的Dock2缺陷患者中CD4+T细胞，CD19+B，CD16/CD56+NK细胞减少［32］。此外，一项涉及5名DOCK2双等位基因突变儿童的临床研究表明，与健康对照组相比，这些儿童淋巴细胞减少，T、B、NK细胞反应受损，其中NK细胞的脱颗粒、肌动蛋白极化和ERK信号通路存在缺陷［33］。简而言之，Dock2调节NK细胞的细胞毒性、脱颗粒和IFN-γ的分泌。

NKT细胞在先天性和适应性免疫之间起桥梁作用，并具有T细胞受体（TCR）和NK细胞谱系受体的表达［34］。与WT小鼠相比，Dock2-/-小鼠胸腺、脾脏和肝脏的NKT细胞数量明显减少［35］。小鼠CD1d限制的Vα14 NKT细胞是淋巴细胞一个独特的亚群，在肿瘤监测和宿主防御病原体起着重要的作用［35］。用Vα14NKT配体刺激的Dock2-/-小鼠的NKT细胞几乎没有检测到细胞因子的产生，并且Dock2缺陷的Vα14NKT细胞相对于对照细胞在早期发育受损［35］。DOCK2双等位基因突变患儿外周血NKT细胞数量也明显减少［33］。这些结果表明，Dock2可能影响T细胞前体向Vα14 NKT细胞的转化发育和增生，但确切的机制目前还不清楚。

4 Dock2调控中性粒细胞迁移、ROS的产生和NETs的形成

中性粒细胞是在组织损伤或发生感染时参与炎症反应的主要白细胞群，受化学引诱物（如脂质、N-甲酰化肽，补体，过敏毒素和趋化因子等）诱导而募集到炎症部位参与先天性免疫应答。中性粒细胞通过化学引诱物与七螺旋G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptor，GPCR）结合在Rho家族调节下诱导趋化反应和释放活性氧（Reactive oxygen species，ROS）等介质来识别和吞噬微生物［36-37］。由于Rac是NADPH氧化酶的胞质组分［38］，趋化剂诱导Dock2-/-中性粒细胞相比于WT中性粒细胞的Rac1/2表达下降，趋化能力和ROS的产生显著下降，并且中性粒细胞胞外杀菌网络（Neutrophil extracellular traps，NETs）形成也受损［39］。NETs是以DNA骨架，起间镶嵌具有杀菌和增加通透性功能的蛋白，以网状结构呈现，活化的中性粒细胞能够形成NETs来捕获并消灭病原体，参与机体的抗菌作用［40］。趋化剂N-甲酰基-甲硫酰基-亮氨酰-苯丙氨酸（N-formyl methionyl-leucyl-phenylalanine，fMLP）可由大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等细菌产生［41］，强烈刺激中性粒细胞的趋化反应［42-43］。研究表明，显微镜分析观察到在第30 s通过fMLP诱导B6和Dock2-/-中性粒细胞，B6中性粒细胞在30 s时表现出局部的F-actin积累，而Dock2-/-中性粒细胞几乎没有，虽然在第60 s后部分恢复［44］。与此结果一致的是，大多数处于趋化状态的Dock2-/-中性粒细胞表现出异常的形态，F-actin的分布范围较为狭窄，说明F-actin的积累需要Dock2的激活。体内实验也表明Dock2-/-小鼠在柠檬酸杆菌感染期间，其中性粒细胞从结肠粘膜下层向固有层的迁移存在缺陷［44］。在DOCK2剪切位点突变（c.2704-2A＞A）的患者中也发现中性粒细胞在细胞骨架重排和形状改变方面存在缺陷，F-actin聚合减少，而这都是中性粒细胞极化和趋化所必需的。因此，Dock2对中性粒细胞的迁移、ROS产生以及NETs形成起到了十分重要的作用。

5 Dock2调控pDCs细胞的抗病毒功能

根据树突状细胞的形态、细胞表面标志物及其功能，将其分为髓系树突状细胞（Myeloid dendritic cells，mDCs）和浆细胞样树突状细胞（Plasmacytoid dendritic cells，pDCs）［45］。mDCs主要作为抗原呈递细胞，向T细胞呈递抗原，而pDCs主要产生Ⅰ型干扰素（Type I interferons，IFNs），对宿主防御病毒感染至关重要［46-47］。虽然Dock2并不直接影响pDCs的发育，但Dock2的缺失减弱了化学刺激诱导的Rac激活和pDCs的迁移反应［48］。相比之下，Dock2-/-mDCs在Rac激活和迁移方面没有缺陷，这可能是由于Dock1和Dock5在细胞中功能性的补偿［48］。研究表明，与WT小鼠的pDCs相比，Dock2-/-pDCs中Ⅰ型IFNs显著减少［33，49］。虽然Dock2不影响TLRs的募集，但它调节了pDCs中TLR7和TLR9的激活，进而导致Ⅰ型IFNs的减少［49-50］。当RNA和DNA分别识别TLR7和TLR9后，pDCs不仅产生炎性细胞因子，还产生大量Ⅰ型干扰素［51］。因此，通过Dock2激活Rac途径与TLR识别微生物结构途径协同诱导pDCs产生IFN-α［51］。虽然目前还不清楚核酸配体如何激活Rac的确切机制，但是Dock2可能参与了pDCs中Ⅰ型IFNs的产生，从而增强其抗病毒功能。

6 Dock2抑制剂

虽然免疫反应对保护自身机体至关重要，但它们也会损伤组织［52］。某些组织和器官，包括眼睛、大脑、怀孕的子宫等，其存在着局部抑制免疫反应的特殊微环境。研究发现Dock2介导的Rac激活和白细胞迁移被胆固醇硫酸盐（Cholesterol sulfate，CS）有效抑制，CS是一种天然存在的化合物，以相对较高的浓度存在于屏障组织的上皮层中［53］。CS能够通过和Dock2的结构域结合抑制其GEF活性，研究表明含CS的眼药水可以有效抑制紫外线和抗原诱导的眼部表面炎症［53］。此外，发现Dock2-/-小鼠有显著心肌组织学病变、移植排斥、T细胞活化和迁移的减少［54］。活化淋巴细胞的组织浸润是移植排斥和器官特异性自身免疫性疾病的标志［55］。

当用小分子抑制剂4-［3′-（2″-氯苯基）-2′-丙烯-1′-亚烷基］-1-苯基-3，5-吡唑烷二酮（4-［3′-（2″-chlorophenyl）-2′-propen-1′-ylidene］-1-phenyl-3，5-pyrazolidinedione，CPYPP）处理淋巴细胞时，趋化因子受体和抗原受体介导的Rac激活均被阻断，导致趋化反应和T、B细胞活化显著降低［55］。因此抑制Dock2可能会提高移植成功率，Dock2可能是控制器官移植中移植物反应等免疫相关疾病的合适分子靶点［55］。随着对Dock2抑制剂的研究不断深入，CPYPP被用作药物时存在很大的问题，由于CPYPP能与DockA亚家族的DHR-2结合，不是特异性作用于Dock2，而且这种交叉反应可能会引起不良反应，如成肌细胞融合和骨形成，所以研究方向开始转向中型和大分子的抑制剂，如多肽DCpep-3以及DCpep-4肽，它们具有更高的效价和特异性。在人B淋巴细胞迁移实验中，这些肽对人B淋巴细胞Dock2与Rac1的结合有抑制作用，并且在无细胞实验表明这些肽对Dock2有选择性抑制活性［56］。由于机体对大分子吸收存在一定的阻碍，研究发现Dock2选择性抑制肽与细胞穿透肽（Cell-penetrating peptide，CPP）结合可以改善细胞迁移实验中的抑制活性，其中PB1-F2片段5（PB1-F2 fragment 5，PF5）和寡聚精氨酸（Oligoarginine）与CPP共轭结合在较低的全身毒性、较高特异性定位和细胞摄取上效果最好［57］。

对Dock2抑制的研究已在各种体外试验中进行，但在体内的应用还未十分明确，已有研究证明在心血管外科上对移植物静脉中敲低Dock2表达与对照相比显著减少了新内膜的形成［58］。此外，Dock2沉默处理还改善了手术后的血流动力，因此Dock2的沉默能够抑制在心血管外科上移植血管所致的新生内膜增生［58］，尽管如此，Dock2抑制剂真正在体内应用仍然存在未知性，它们很可能被广泛分布的血管壁吸收，从而导致在局部组织中有效浓度不足，并且对其正式临床使用的安全性仍然存在一定的质疑。从长远来看，Dock2抑制剂有可能有助于改善同种异体移植排斥反应、自身免疫性疾病等治疗。

7 展望

Dock2与Dock1、Dock2、Dock5同属于Dock-A亚家族，是一种非典型的GEF。对Dock2的结构分析能够靶向阻断其与其他分子的结合，有助于进一步增加通过调节Dock2来进行临床治疗的理论依据。

目前研究显示Dock2基本是通过调节Rac来发挥作用，但是它却在不同免疫细胞中影响不同的功能。Dock2缺陷导致淋巴结和脾脏中的T细胞数目和比例的减少，影响T细胞发育过程中的阳性和阴性选择。Dock2调控B淋巴细胞发育、活化，影响浆细胞的分化和特异性IgG抗体的产生。除此以外，Dock2影响NK细胞的细胞杀伤功能和脱颗粒作用，调控中性粒细胞的迁移、ROS的产生和NETs的形成等，揭示了Dock2对各种免疫细胞的重要作用，几乎影响着免疫细胞发挥生物学功能的整个过程，并且已经证明在各种炎症性疾病的发展中起关键作用，包括过敏性疾病、HIV感染和炎症性肠病等［44，51，59］。此外，在结直肠癌中高表达的Dock2是其新型预后标志之一，提示Dock2可能是治疗结直肠癌的新靶点［60-61］。总的来说，虽然Dock2对各种免疫细胞的功能调节不尽相同，在参与先天性免疫和适应性免疫过程的具体机制也仍不清楚，但是对免疫细胞发挥正常的功能产生极大的影响。Dock2缺陷的患者细胞表现出多种缺陷，包括T细胞和B细胞的趋化反应、NK细胞的脱颗粒、中性粒细胞产生ROS和外周血单核细胞产生Ⅰ型干扰素［62］。通过对Dock2缺陷患者的鉴定也显示Dock2在人类免疫细胞中发挥着关键作用。总之，Dock2对于调节免疫细胞从而影响疾病的发生发展至关重要，未来对Dock2功能的研究将有助于这些疾病的治疗。

此外，现有一些Dock2的抑制剂，如多肽DCpep-3以及DCpep-4已被证明可以用于抑制淋巴细胞的迁移和激活。为了更好的达到效果和提高Dock2抑制剂的可行性，研究证明了Dock2抑制剂和CPP-共轭分子的结合有利于基于Dock2选择性抑制的新型抗炎药物的开发。虽然CPP已用于各种体外试验，但报道的与CPP-共轭分子结合的药物在临床上例子却很少。直接在人体内使用CPP仍然具有挑战性［63-64］。为了成功使Dock2选择性抑制剂用于临床，需要持续的进行临床前的研究。因此，未来去寻找更加安全和更高效率的靶向Dock2的抑制剂的研究非常重要。

综上所述，本文总结了Dock2对各种免疫细胞功能影响的最新进展，这对研究与Dock2相关的免疫性疾病的发生发展机制及诊断、治疗等具有重要意义。Dock2在各种免疫细胞的生理性的功能至关重要，因此对免疫系统稳态和免疫功能调节中起着关键的作用。然而，目前对Dock2的作用及机制还有许多尚未明确的地方，值得进一步深入研究。