乙型肝炎表面抗原清除在临床治疗与药物研发中的作用

邓芮 符筱 孙剑

全球约有2.57亿慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者，慢性乙型肝炎(CHB)又是导致肝硬化、肝细胞癌(HCC)和肝脏相关死亡的主要因素，防治HBV感染已成为全球公共卫生问题。由于聚乙二醇干扰素(PEG-IFN)和核苷(酸)类似物(NAs)均可抑制HBV复制并延缓疾病进展，目前这两种药物已被批准用于CHB的治疗。然而，在现有治疗下，CHB患者通常难以实现完全治愈[1-2]。通常认为，CHB患者理想的治疗终点是乙型肝炎表面抗原(HBsAg)持续检测不到，伴或不伴HBsAg血清学转换，因为后者意味着患者对HBV产生了免疫力，预后良好[3]。然而，由于肝内共价闭合环状HBV DNA(cccDNA)持续存在，CHB患者很少发生HBsAg清除和血清学转换。虽然有报道部分CHB患者可自发实现HBsAg清除和血清学转换，但其发生率并不确切，因为它受到多种患者特征如年龄、肝硬化、HBeAg状态、HBV DNA水平和血清HBsAg水平等的影响[4-5]。既往研究表明，HBsAg清除的年发生率从0.12%到2.38%不等[4, 6]。宿主对HBV的免疫应答与HBV感染的自然史密切相关，CHB的发病则与T细胞和B细胞免疫应答耗竭有关，而HBsAg在该免疫致病过程中也发挥着重要作用。因此，本文着重概述在当前治疗下血清HBsAg清除的现状，并为开发能有效清除HBsAg的新疗法提供线索，帮助CHB患者早日实现治愈。

一、血清HBsAg的来源和检测

完整的HBV颗粒结构包括内层的核衣壳及外层的包膜，其中包膜由大、中、小三种外膜蛋白所组成，即L-HBsAg、M-HBsAg和S-HBsAg。L-HBsAg(PreS1结构域)N端的75个氨基酸与HBV受体(人牛磺胆酸钠协同转运多肽受体，hNTCP)的157至165个残基之间的亲和力高，在病毒附着并感染肝细胞的过程中起着至关重要的作用。HBV侵入肝细胞后，在细胞质中脱去HBsAg，核衣壳进入感染细胞的胞核内，其中包含的松弛环状部分双链DNA(rcDNA)随后被补齐并转化为cccDNA。cccDNA以微型染色体的形式存在于感染肝细胞的胞核内，是HBV复制转录并翻译成HBsAg等病毒蛋白的模板。因此，血清中HBsAg的定量水平可在一定程度上反映cccDNA的转录情况，从而可用作疗效评价的临床指标。目前，随着高灵敏度和特异性的HBsAg检测方法推出市场，HBsAg水平在疾病进展及复发风险分层和治疗应答预测等方面的价值重新受到了关注。但值得注意的是，cccDNA并不是HBsAg的唯一来源，宿主基因组中的HBV DNA整合片段同样可以产生HBsAg[7]。因此，即使阻断HBV cccDNA的复制和转录，也不能完全抑制HBsAg的产生。

二、血清HBsAg的清除：发生率和临床意义

慢性HBV感染的自然史有五个不同阶段[1]：第一阶段为HBeAg阳性的慢性HBV感染，表现为HBeAg阳性、HBV DNA高水平但丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平正常；第二阶段是HBeAg阳性的CHB，表现为HBV DNA和ALT高水平，伴有中重度肝脏炎症坏死，大多数患者可发生HBeAg血清学转换，从而进入HBeAg阴性的慢性HBV感染的第三阶段。本期患者抗-HBe阳性，HBV DNA < 2 000 IU/mL或检测不到，ALT水平正常，在此阶段病毒基因最有可能整合到宿主基因组中，血清HBsAg仍为阳性；一些患者则发展到第四阶段，即HBeAg阴性的CHB(再激活期)，特征为HBeAg转阴，但血清HBV DNA和ALT均处于中高水平；而第五阶段则为HBsAg阴性阶段，特征在于血清HBsAg阴性，伴或不伴抗-HBs出现。

值得注意的是，自发性HBsAg清除的定义为间隔至少6个月两次检测血清HBsAg一直保持阴性，其在CHB感染自然史中很罕见，且通常发生在处于非活动期至少10年的患者中[8]。一项荟萃分析结果显示，世界范围内自发性HBsAg清除的年发生率为1%～2%[9]。血清HBsAg清除率与感染时的年龄以及基线时HBV DNA和HBsAg的水平均有关。围产期感染HBV的患者其血清HBsAg清除率要低于成年后感染者，而基线HBV DNA水平较低和HBsAg水平较低的患者发生HBsAg清除的概率更高。此外，与HBsAg持续阳性的携带者相比，获得HBsAg清除者发生HCC的风险显著降低[10-11]。但是，尚无充分证据支持HBsAg清除率与性别、HBV基因型或治疗史有关。

三、HBsAg和免疫系统

一方面，当宿主受到HBV攻击时，机体免疫系统启动免疫防御，免疫细胞激活，分泌大量的细胞因子，抑制HBV感染并清除HBsAg。多种先天性和获得性免疫细胞，如自然杀伤(NK)细胞、树突状细胞(DCs)、细胞毒性T淋巴细胞以及浆细胞等均参与了此复杂的调控过程。除外周血中循环的免疫细胞外，肝脏驻留的免疫细胞同样在早期免疫监视方面发挥着重要作用。但是，血清HBsAg清除的免疫机制尚未详细阐明。

另一方面，当机体免疫系统对抗HBV感染的过程出现动态失衡，产生肝脏慢性炎症和坏死，表现为CHB。慢性HBV感染可抑制外周免疫细胞及肝细胞的免疫应答，并使得抗病毒细胞因子的分泌减少，而HBsAg与该免疫逃逸过程密切相关。首先，HBsAg可干扰固有免疫信号通路，抑制多种固有免疫细胞的激活，如HBsAg持续阳性的CHB患者外周血和肝脏中DCs的增殖和分化成熟受到抑制，其表面的Toll样受体表达下调且相应信号通路也受影响。此外，持续表达的HBsAg还会降低机体NK细胞的数目及细胞的杀伤能力。除了对机体固有免疫有抑制作用外，HBsAg还与获得性免疫细胞(包括T细胞及B细胞)的数目减少及功能耗竭有关。

四、当前疗法下HBsAg清除的现状

CHB的治疗目标是减少终末期肝病和HCC的发生，延长患者生存时间和改善患者生活质量。血清HBsAg清除与肝脏功能及长期预后改善相关，是目前推荐的理想治疗终点，也可作为评估患者生存改善的替代指标[3]。目前指南推荐的CHB治疗方法主要包括PEG-IFN和NAs，前者有免疫调节和直接抗病毒双重作用，后者则直接抑制病毒聚合酶的逆转录功能，单药治疗即可有效抑制HBV复制，但两种疗法在清除HBsAg方面的疗效均有限。PEG-IFN应用一定疗程(通常是48周)后可诱导持续应答，但其局限性在于患者的应答率低且耐受性较差；而口服NAs药物虽抗病毒效力高且患者耐受性好，但由于无法清除感染肝细胞核内的cccDNA，患者通常需要长期甚至终生用药。目前一线的口服抗病毒药物主要包括恩替卡韦(ETV)、替诺福韦二吡呋酯(TDF)和替诺福韦艾拉酚胺(TAF)。

(一)IFN治疗下的HBsAg清除 既往研究表明，PEG-IFN治疗48周可促进机体对HBV的免疫控制，单用PEG-IFN治疗的患者HBsAg清除率要比拉米夫定单药治疗者更高[12-13]。同时，在停用PEG-IFN治疗后，患者仍可维持病毒抑制状态，并有部分DNA持续检测不到的患者(持续应答者)可维持长期HBsAg阴性。

(二)NAs治疗下的HBsAg清除 NAs作为口服抗病毒药物，主要以耐受性好、疗效佳著称。其中ETV和TDF用药后95%以上的患者可实现病毒转阴，且耐药屏障高。对HBeAg阳性CHB患者HBsAg动态变化的观察显示[14]，TDF治疗5年后的HBsAg清除率约为10%，并且在白人患者中更常发生HBsAg清除。与TDF单药或单用PEG-IFN治疗的患者相比，TDF联合48周PEG-IFN治疗的患者其HBsAg清除率要更高，且主要发生于基因型A的HBV感染者中[15]。但联合治疗下HBsAg清除的持久性尚未明确，仍需要对联合治疗后实现了HBsAg清除的患者进行长期随访，制定出最佳的联合治疗方案，帮助更多的CHB患者实现并维持HBsAg清除。

(三)HBsAg下降预测PEG-IFN治疗应答 现有疗法对血清HBsAg清除具有一定作用，同时血清HBsAg水平下降也可以预测PEG-IFN治疗结束后的持续应答情况，因而在治疗早期即可识别出应答者。一项纳入了48例PEG-IFN-2α治疗的HBeAg阴性患者的研究表明[16]，治疗第12周HBsAg水平降低0.5 log10 IU/mL对持续应答的阴性预测值为90%，阳性预测值为89%；当治疗到第24周，HBsAg水平降低1 log10 IU/mL的相应阴性预测值为97%，阳性预测值则为92%。这项研究首次揭示，监测PEG-IFN治疗早期(12周内)患者的血清HBsAg水平有助于区分持续应答者和无应答者。

(四)HBsAg定量预测NAs停药后应答情况 近年来，研究者开始关注NAs停药对HBsAg清除的作用[17-18]。但在设计NAs停药研究时，除了关注停药后的HBsAg清除率，NAs停药后的复发风险也不容忽视。因此需要寻找停药时的病毒相关指标对NAs停药后的应答情况进行预测，以确定最佳停药时机。一项针对亚洲CHB患者的系统综述报道[19]，停药时的HBsAg水平对于NAs停药后的应答情况(包括停药后复发风险及停药后HBsAg清除)有一定预测作用，HBsAg定量<100 IU/mL可能代表较好的停药时机。一方面，对HBeAg阴性的亚洲CHB患者进行停药并随访39个月，发现停药时HBsAg定量水平分别处于< 100 IU/mL、100～200 IU/mL、100～500 IU/mL、> 500 IU/mL和> 1000 IU/mL这5个范围的患者HBsAg清除率分别为21.1%～58.8%、25.5%、4.4%、2.3%和0.0%。另一方面，停药时HBsAg水平<100 IU/mL的患者停药1年后的病毒学复发率明显要低于停药时HBsAg定量> 100 IU/mL的患者，前者复发率仅为9.1%～19.6%，可认为在该前提下对符合条件的患者进行停药较为安全。

此外，为进一步明确NAs停药能否促进HBsAg清除，我们中心正在开展一项以经过NAs治疗达到HBsAg定量≤200 IU/mL的CHB患者为研究对象，基于新型病毒学指标(HBV RNA或HBcrAg)指导停药的前瞻性随机对照研究，希望通过该研究获取有关HBsAg清除的新证据，帮助更多的CHB患者实现临床治愈。

(五)新型疗法下HBsAg清除的前景 目前研究者们仍在探索新的CHB治疗策略，包括研发针对HBV复制周期各个阶段的抗病毒药物(如病毒进入、病毒复制、cccDNA产生和病毒蛋白释放等相关抑制剂)，同时也包括各种免疫调节类药物[20]。这些新药均可作为现有PEG-IFN和NAs疗法的补充，有望能帮助CHB患者早日彻底清除血清HBsAg，实现临床治愈。通过抑制cccDNA的转录或病毒mRNA的翻译，HBV的基因表达受到抑制，血清HBsAg的水平将得以下降。目前靶向HBsAg的药物主要有三大类，第一类主要直接抑制HBsAg的释放，第二类通过促进HBV cccDNA清除或功能性沉默以减少HBsAg的产生，第三类则通过小干扰RNA下调HBsAg的表达。其中，核酸聚合物(NAPs)是一类新型的广谱抗病毒化合物，可通过阻断受感染的肝细胞释放HBsAg来抑制HBV感染。此外，NAPs阻断了血清中HBsAg的补充，可以增强免疫治疗(如PEG-IFN)的疗效，有助于促进宿主免疫介导的病毒清除，具有重要的临床意义。目前，已有部分NAPs(如REP 2139、REP 2055和REP 2165等)进入了临床试验阶段，评估其在单药治疗和联合治疗中的效果。结果显示NAPs对HBsAg清除的作用强，且安全性良好，但有关HBsAg会否在细胞内潴留而具有潜在细胞毒性以及NAPs在肝脏中蓄积的问题仍需进一步观察和研究。

血清HBsAg清除对CHB患者十分重要，可降低HCC发生风险，但在HBV感染自然史中尤为罕见。目前应用PEG-IFN和NAs抗病毒治疗可抑制HBV复制，改善CHB患者的预后，但并不能完全清除HBsAg。研究表明，HBsAg可导致先天性和获得性免疫功能受损，T细胞和B细胞应答耗竭，因此降低血清HBsAg水平有助于恢复宿主的免疫系统，但HBsAg清除的免疫学机制尚不清楚。由于感染的肝细胞内存在持续表达HBsAg的cccDNA和整合的HBV DNA，加上慢性HBV感染导致肝脏微环境处于免疫抑制状态，彻底清除HBV仍面临着重大的挑战。通过直接抑制HBsAg的生成和释放、促进HBV cccDNA的清除或功能性沉默等均可降低HBsAg水平，针对病毒的特异性免疫应答也将得以恢复。未来对抗病毒药物及免疫调节类药物的研发也仍需继续关注其清除HBsAg的能力，开发高效靶向HBsAg的联合疗法可进一步诱导抗HBV特异性免疫应答，并最终实现CHB的功能性治愈。