超声波技术在红芪多糖提取及分子修饰中的应用研究进展

李芳蓉，田永峰，陈 鑫，张建军

(甘肃中医药大学 药学教学部，甘肃 定西 743000)

红芪(radix hedysari)是甘肃省重要的道地特产名贵药材，系豆科植物多序岩黄耆(原变种)的干燥根[1]，性微温，味甘，归脾、肺二经，具有固表止汗、升阳益气、排毒利尿消肿、排脓和敛疮生肌等功效[2-3]。现代药理研究表明：红芪能够强心利尿、抗病毒、提高免疫力[4-5]、抗自由基等[6-7]，同时还具有抑制金黄色葡萄球菌、结核杆菌及降压作用。相关药理活性研究多集中于免疫调节[8]、抗衰老、对心血管和内皮细胞损伤保护、减轻糖尿病并发症、降血糖、强心利尿、抗炎、抗自由基[9]、抗病毒、抗肿瘤和神经保护作用[10-11]等药理作用。红芪有滋补作用，自古除药用外，还用于做汤、炖肉、泡酒等，开发利用价值十分可观[12]。

目前，恶性肿瘤已成为威胁人类生命的头号恶性疾病。因此，医药学研究者都在寻找天然优质、疗效确切、低毒无副作用的抗肿瘤药物。红芪多糖(Hedysarum polysaccharide，HPS)，低毒且免疫活性强[13-14]，是红芪主要活性成分，备受医者青睐。红芪在抗肿瘤和提高免疫力[15]方面应用前景广阔。红芪的抑瘤效应主要由红芪多糖产生，抑瘤作用的基本机制皆通过调节机体免疫系统功能发挥作用[1, 16]。红芪多糖对糖尿病模型大鼠视网膜血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、色素上皮细胞衍生因子(pigment epithlium-derived facto, PEDF)及血清C反应蛋白(C-reactive protein, CRP)表达具有影响，能够改善视网膜受损的程度[17]。HPS可以通过调控氧化应激的方式改善db/db小鼠的糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)心肌损伤。其机理是通过增加Nrf2的表达影响抗氧化酶类的表达[18]。随着老龄化社会的来临，阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)的发病率日渐升高，极大危害了老年人身心健康，严重降低生活质量，加重社会与家庭的生活及经济负担。HPS具有良好保护AD细胞模型存活率下降的作用[19]。Aβ1-42诱导的SH-SY5Y受HPS作用后可以使多种蛋白表达量变化明显，这些蛋白质可能是HPS发挥抗AD作用的关键蛋白靶点。这方面的研究，在蛋白质水平上可为HPS的神经保护作用机制探讨和中药新药HPS及其衍生物的研发提供科学依据和数据支持[20]。HPS在抗肿瘤和阿尔茨海默病治疗中的应用，使得有关提取与分子修饰的研究具有极其重要的意义。

本文综述了近年来有关超声波技术在红芪多糖的提取和分子修饰方面的应用研究现状，总结现阶段研究的成果与不足，展望了未来的研究方向和发展趋势，旨在为超声波技术在红芪多糖的提取和分子修饰方面应用和进一步研究与开发提供参考。

1 中药有效成分超声波提取及其特点

1.1 中药有效成分的超声波提取

超声波的声学频率为2×104～109Hz，频率高、波长短、穿透力强、方向性好[21]。超声波有许多物理性能比较特殊，且安全性高，没有任何化学残留，操作简便高效[22-23]，故其在医疗卫生、生物技术、工农业生产和食品工业等方面应用广泛且意义重大[24]。

天然药物有效成分超声波提取是先根据需要将中药材切碎或粉碎，放入已加入提取介质(或称溶媒，如H2O、CH3CH2OH或其他有机溶剂等)且外壁粘接换能器振子的容器内；当超声波发生器开启时，超声波由换能器振子振动发出进入提取介质，高强度的超声传播伴随着一系列高强度剪切波和压缩，又产生冲击波。冲击波在提取介质中产生强烈的机械搅拌作用、超声空化效应、热效应和化学效应等。一方面，冲击波下压力陡降形成微型空腔，导致外溢巨大能量，将药材的细胞壁有效破碎，使中药材有效成分呈游离状态释放，并溶入提取介质，提取效率提高[25-26]；另一方面，可使提取介质分子运动速度加快，穿透力增强，使药材中的有效成分与提取介质相互快速接触并混合、溶合[27]。因此，简言之，超声辅助提取是通过超声波的强烈而高速的搅拌作用及空化效应，使中药植物细胞壁易于破碎，有利于有效成分的溶出和释放，提取效率提高[28]。

1.2 中药有效成分超声波提取的特点

超声波提取具有的特点[29-30]：①提取充分、效率高。独特的物理性能使得超声波足以使植物细胞组织变形甚至破壁，从而充分提取中药有效成分，较传统工艺提取率显著，提高率达1～10倍。②提取处理量大，耗时短。通常超声波辅助强化中药有效成分提取获得最佳提取率仅需24～40 min，提取时间较传统方法大大缩短，超过2/3，能够大量处理药材原材料。③提取温度低、能耗小，对药材有效成分具有保护作用。超声提取中药材的最佳温度仅高于室温15～45 ℃，能够大量节省能源，同时对药材有效成分中热稳定差、易氧化或水解的组分具有良好的保护作用。④提取适应性广泛。超声波辅助提取的中药材成分不受分子大小及极性的限制，绝大多数种类中药材和各类成分的提取均可适用。⑤提取物易于分离和纯化。超声提取过程中药液未掺入杂质，提取后的有效成分易于分离、纯化。⑥提取成本低、经济效益高。超声提取中药材有效成分工艺运行成本低，综合经济效益显著。⑦常压提取，安全性好，操作简便，设备易于保养维护。超声提取在自然压力下进行，操作安全，操作工艺简单，操作方便易行，超声提取设备的保养、维护都很简便[31]。

2 中药多糖的分子修饰及超声波的分子修饰作用

2.1 中药多糖的分子修饰

国内外相关研究结果均表明，多糖的生物活性决定于多糖的分子量、分子结构、取代基种类、数目及其位置关系[32]。中药多糖分子修饰是以物理、化学和生物等手段对多糖的主、侧链的功能基团或某些特殊结构进行修饰改造，使多糖的某些理化性质及空间结构发生改变，以增强其生物活性[33-34]。多糖修饰通常包括降解修饰和接枝修饰两类，所谓降解修饰即采取的方法使多糖分子结构中的部分基团脱落以制备较低分子量的多糖；而接枝修饰正好相反，即对多糖经进行修饰改造，在其分子中增加功能基团，增大相对分子质量。经过中药多糖的分子修饰能得到各种结构类型和不同生物活性的多糖衍生物，奠定了分析多糖分子结构与功能关系的基础。其研究成果可直接为多糖分子修饰指明方向，为未来多糖类药物的研究、设计和开发获取理论依据[35]。经修饰可引起多糖分子的空间结构，相对分子质量，取代基类型、数目及位置等的改变[36]，从而影响多糖的理化性质及生物活性，故优选适当方法进行多糖分子结构的修饰，以改善其理化性质，增强其固有的生物活性或增加新生物活性，为研究多糖结构与活性之间的关系奠定基础。

2.2 超声波对多糖的分子修饰作用

超声波修饰多糖的作用属于物理降解修饰，是高效、绿色的方法，操作简单，条件可控性好。与其他方法相比较，超声波降解修饰法具有节能省时、操作程序简化、反应速率快、有机溶剂使用量减少，降解过程中对多糖分子中的活性基团破坏少，对环境造成的危害显著降低等优点[37]。现有研究认为超声波降解修饰多糖主要机理是自由基氧化还原反应与机械断键作用。自由基氧化还原作用指超声波在溶剂中传播时，在足够大的声强和负压作用下，使溶剂的平均分子间距增大至超过极限距离后破坏其结构完整性，形成空穴并爆裂产生温度剧变和局部性高压[29]，提供自由基产生所需能量。空穴释放的冲击波能量使聚合物降解[38]。热效应和自由基对低分子量物质较有效；机械效应对高分子物质更有效，且随物质分子量的增加而增加。不同自由基由不同类型的溶剂形成，造成的超声波的反应结果也不相同；而机械性断键作用则是指在弹性机械波超声波的作用下，溶剂分子产生激烈而快速变化的机械运动，从而提供足够能量并对多糖分子的共价键进行剪切断键，降解多糖分子[39-40]。

3 超声波提取红芪多糖及对其分子修饰作用的研究情况

超声波的强烈、高速的搅拌作用和空化效应，使超声提取多糖时，中药材细胞壁易于破碎和多糖溶出，提取效率较高[20]。与传统的提取技术相比，超声波提取技术具有快速、省时、节能、高效、环保等独特优势。因其属低温操作，更有利于保护有效成分[41]，故其在中药有效成份的提取中的使用呈逐渐上升的趋势。

超声波提取技术在HPS的提取和修饰上也有应用研究。杨秀艳等[42]以HPS得率与含量为测定综合指标，采用复合酶联合超声波提取技术，利用单因素试验和正交试验，优化筛选最佳提取组合，同时对复合酶联合超声提取多糖(HPS-MC)的各种组分与热水浸提多糖(HPS-R)的理化特性及体外抗氧化活性进行了对比分析。所得最优条件是复合酶配比1∶1、酶解pH5，超声功率105 W、时间1 h，多糖得率13.37%～14.65%，多糖质量分数90.98%～93.92%。相较于HPS-R，HPS-MC的绝对黏度、相对分子质量及蛋白质含量均降低，但糖醛酸含量增加，HPS-MC 比 HPS-R的抗氧化活性高；故复合酶联合超声波提取技术操作简便、环保经济，提取所得HPS具有明显的抗氧化活性。胡燕等[43]以正交实验法对HPS的提取工艺进行研究。最佳工艺条件是超声功率128 W，超声时间0.5 h，温度80 ℃，料液比1∶30。结论是此超声波提取HPS的方法简单、快捷、高效。寇宁等[44]分别采用常规热水浸提、超声辅助及微波辅助从红芪中提取HPS，再进行脱蛋白、冷冻干燥等步骤后得到3种方法提取的HPS-H、HPS-C和HPS-M。同时，将3种HPS进行了凝胶渗透色谱(gel permeation chromatography, GPC)测定和红外光谱分析，以及清除羟自由基、DPPH自由基、超氧阴离子自由基和还原力测定的体外抗氧化活性试验。结果表明：重均分子量分别为5.13×105、4.56×105和6.29×105，HPS-M的体外抗氧化活性要明显高于HPS-C和HPS-H，结论是HPS提取可首选微波辅助法。刘宝剑等[45]对超声波-微波联合与常规法提取HPS进行了对比研究。所得HPS以苯酚-硫酸比色法测定其含量。结果表明两种方法所得多糖含量差别较大，超声波-微波法与常规法所得多糖含量分别为8.98%和4.19%。超声波-微波法提取HPS具有高效、省时，仪器简单，操作简便快捷的明显优势，亦可避免其分解。王新玲等[46]采用超声辅助提取红芪根中HPS，其含量以紫外-可见分光光度法测定。结果表明HPS含量为9.01%。方法操作简便，灵敏度高，可作为HPS的提取和含量测定方法。

4 现状和存在的问题

利用超声波技术提取红芪多糖的研究主要集中在：通过超声波的不同功率、温度组合以及一定的料液比组合以提高红芪多糖的提取率、缩短提取时间和节约能源方面，缺少关于超声波提取中超声波的作用机理及其对HPS的分子修饰作用等方面的研究；各研究者使用的仪器不统一，实际工作中，按照文献描述进行操作的结果重现性较差；超声波的功率、频率、温度及提取液的pH值组合与所提取HPS分子量大小的关系研究相对较少；缺少用超声波对鲜红芪和干燥红芪中多糖提取的比较研究；较少进行不同条件下利用超声波提取所得HPS的药理活性的比较研究。

5 应用前景与趋势

超声波辅助提取是一种重要的提取方法，具有提取率高、用时较短、温度较低、溶剂消耗较少的优势，且所得多糖抗氧化能力较强。将超声波技术应用于中药红芪中HPS的提取尚处于初期发展阶段，对其作用机理和分子修饰作用仅有零星的研究，此方面的应用研究前景广阔。与微波辅助及复合酶等多种技术联用可以使2种或多种技术优势互补，相得益彰。在提高提取效率的同时对HPS进行选择性的分子修饰，从而提取出用途更加广泛、药理活性更高、治疗效果更加显著的红芪多糖或其复方药剂，从而更加充分地发挥其在恶性肿瘤、阿尔茨海默病等重大疾病治疗中的独特优势。因此，进行超声波提取与多种技术联合和对分子修饰作用的研究和调控，以及所得HPS分子量大小及药理活性的对应关系的研究，将是超声波技术在中药红芪HPS提取中应用的重要研究方向。同时，研究各频段、不同功率组合的超声波与提取效率、分子修饰作用、所得HPS分子量大小及药理活性的对应关系，研制提取特定成分的标准超声波提取仪器等，具有重要的现实意义。