干细胞在糖尿病足溃疡修复中的研究进展

罗彬彬 王 鹏 陈 永 张红艳

（南昌大学第一附属医院烧伤科，江西 南昌 330006 ）

我国的糖尿病发病率正逐渐增加。据估计，2015年全球糖尿病人数已达到4.15亿;到2019年，全球有4.63亿糖尿病患者(20～79岁)。预计到2045年，这一数字将增至6.93亿，糖尿病患病率将升至9.9%[1]。糖尿病足溃疡（DFU）是糖尿病最常见、最严重的并发症，传统疗法包括清除坏死组织、血管重建手术、控制感染、控制血糖、足部护理教育、肢体抬高等[2]。然而，这些治疗往往不能确保令人满意的伤口愈合效果，仍有很高的风险,致残率、致死率偏高，且容易复发。DFU严重影响患者的生活质量和护理质量。因此，亟需探索新的治疗方法促进DFU患者创面的愈合，改善患者的预后。

DFU的发病与糖尿病所致血管和神经病变有关，但确切的机制尚未完全阐明。持续高血糖状态可以通过不同的机制影响伤口愈合，如真皮萎缩、成纤维细胞数量减少和增殖能力下降、前胶原合成减少、创面中基质金属蛋白酶(MMPs)水平增加等，使胶原纤维的破坏速度比它们的形成速度更快，从而延缓了足够肉芽组织的形成。糖尿病也可能通过激活多聚ADP核糖聚合酶(PARP)而损害皮肤结构和破坏皮肤微血管功能，PARP的增加，胶原蛋白合成和分泌的减少、破坏的增加，都可导致DFU的发生[3]。高血糖状态可以通过不同的机制阻碍伤口愈合，糖尿病神经病变导致的感觉缺失可以加重DFU患者足部皮肤的损伤,使DFU迁延难愈；此外，细胞增殖受损和对生长因子的抵抗都可能会延迟DFU伤口的愈合。糖尿病患者中巨噬细胞迁移受损和信号分子释放不足也抑制了新血管的形成。近年来，国内外对各种干细胞移植治疗下肢缺血性相关疾病进行了大量的研究，并取得了显著的疗效。本文主要从干细胞移植治疗DFU的理论机制，以及不同类型的干细胞移植治疗DFU的研究进展作一综述，为糖尿病足的治疗提供参考。

1 干细胞用于治疗DFU的理论依据

伤口愈合是一系列复杂的生理反应，大致分为3个阶段：急性炎症期，细胞增殖期，创面重塑期。机体受伤后，进入急性炎症期，首先是血小板聚集，凝血级联反应启动止血，其次趋化因子血小板源性生长因子(PDGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)释放并吸引巨噬细胞、中性粒细胞和成纤维细胞到伤口周围，中性粒细胞和巨噬细胞清除伤口的碎片和病原体。在细胞增殖期，细胞因子包括白细胞介素1 (IL - 1)、血管内皮生长因子(VEGF)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的释放，促进伤口周围的细胞增殖[4-5]。在创面重塑期，纤维连接素和透明质酸(HA)组成的临时基质在毛囊细胞和邻近表皮干细胞的帮助下发生上皮化，成纤维细胞将以纤维连接素为基础的微纤维转化为富含胶原蛋白的纤维，成纤维细胞还负责产生纤维连接蛋白和蛋白多糖，这些物质形成细胞外基质，在细胞外基质上发生再上皮化和愈合[6]。而发生DFU 后，DFU诱导的成纤维细胞在生长因子的作用下增殖能力下降，巨噬细胞功能下降，胶原积累减少，角质形成细胞和纤维母细胞迁移和增殖能力低下，表皮干细胞能力受损，血管生成减少。血管生成重建了受伤组织的灌注，并为组织提供关键的营养，是伤口愈合的重要机制之一。此外，糖尿病患者内皮祖细胞向损伤部位的迁移潜能减弱，进一步抑制了血管生成潜能。内皮细胞是血管形成和VEGF表达上调的关键。这些因素最终都会影响DFU的伤口愈合[7]。

目前，DFU的常规治疗包括药物治疗、物理治疗和外科治疗，多存在患者住院时间长、费用昂贵、伤口很难完全恢复的问题。干细胞是一种未分化细胞，具有自我更新的能力。干细胞被移植到伤口后，能够促进细胞因子和生长因子的分泌；以直接和旁分泌的方式促进细胞聚集、调节免疫、促进细胞外基质重构和血管生成；并且在一定的条件下，可以分化成功能细胞，并生成多种组织器官[8]。因此，干细胞移植成为治疗DFU的新希望。干细胞可以通过合成和分泌细胞因子以及分化成各种类型的细胞如肌成纤维细胞、角化细胞、内皮细胞等参与创面的愈合[9-11]。因此，我们可以利用干细胞具有分化潜能这一特点，通过干细胞移植促进DFU患者血管内皮细胞因子的表达和新生毛细血管的形成，以达到改善患肢血供、治疗DFU的目的[12-13]。

2 干细胞的来源和分类

目前，用于移植治疗DFU的干细胞主要分为同种异体干细胞和自体干细胞。

2.1 同种异体干细胞 同种异体干细胞包括脐带血干细胞（UCB-MSCs）、胚胎干细胞(ESCs)、人脱落的乳牙干细 胞（stem cells from human exfoliated deciduous teech,SHED）以及胎盘来源间充质干细胞（PDMSCs），它们是间充质干细胞（MSC）获得的主要来源。MSCs具有较强的再生和分化能力。目前，有关MSCs治疗DFU的研究最为广泛。

2.1.1 UCB-MSCs UCB-MSCs与人的其他干细胞具有相似的形态学和相似的细胞表面抗原，具有分化成骨髓间充质干细胞（BMSCs）和脐带来源间充质干细胞(UC-MSCs)的潜能[14]。此外，UCB-MSCs具有细胞倍增时间短、存活时间长、抗炎活性强等优点。因此，UCB-MSCs被认为是一种非常方便和具有多种用途的干细胞。动物研究表明，人UCB-MSCs通过在DFU大鼠腓肠肌和股神经中表达神经生长因子(NGF)，能够预防或治疗DFU[15]。体内实验表明，将异种UCB-MSCs注入DFU患者创面，可在体内产生VEGF和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），使糖尿病创面更具有愈合的能力[16]。在移植UCB-MSCs后，DFU患者整体愈合率为87.5%，高于传统方法治疗DFU的愈合率，也高于其他治疗模式的愈合率[17]，提示UCB-MSCs可能有助于改善此类慢性伤口的愈合。与其他来源的干细胞相比，从人脐带血中分离出的MSCs很容易获得和精制，但由于目前脐带血的保存成本很高，以及涉及隐私和伦理方面的问题，UCB-MSCs在DFU中的应用较少[18]。

2.1.2 ESCs 胚胎干细胞是一种具有多分化潜能、自我更新强的细胞，来自于体外受精胚胎的内部细胞群。胚胎干细胞可以作为未分化细胞系保存在细胞培养基中,并可以被诱导分化成任何细胞系。从胚胎干细胞中提取的内皮细胞和内皮祖细胞可以分泌生长因子，促进创面愈合。在大鼠糖尿病模型实验研究中，Lee等[19]通过在创面局部应用未分化ESCs，证实了其可加速糖尿病大鼠的创面愈合。此外，与未予治疗的伤口相比，使用ESCs治疗的伤口表皮生长因子（EGF）、VEGF和纤维连接蛋白水平显著增加，促进了伤口愈合。但目前ESCs应用于DFU临床治疗的报道较少，部分报道提示其存在安全性等方面的风险。因此，还需要更多的实验研究以确定其安全性与可行性。

2.1.3 SHED 大多数MSCs，来源于骨髓或脐带，这对于供体来说是个侵入性的过程，对供体有伤害，并且脐带来源非常有限。近年来，来自SHED的干细胞作为一种新型干细胞来源引起了广泛的关注，它可以减轻对供体的侵袭性和骨髓抽吸时的创伤，并解决了供体来源有限的问题。SHED具有多向分化、自我更新和高度增殖的能力，还具有较强的神经修复和血管再生的能力，是一种组织再生医学中前景较好的干细胞[20-21]。经SHED处理的施万细胞含有多种细胞因子和趋化因子，可以通过复杂的过程促进周围神经的再生，施万细胞自身的增殖、迁移能力增强，并且部分神经元、细胞外基质和血管生成相关基因的表达显著增强，可观察到细胞活力明显增加，其分泌的多种营养因子可通过多种机制促进周围神经的再生[22]。SHED为周围神经再生创造了更理想的细胞外微环镜，因此，SHED可能为创面修复提供新的治疗方法。SHED还可以分化为血管内皮细胞，分泌多种生长因子，加速新生毛细血管生成[23]。但目前，有关SHED用于人体DFU治疗的临床研究尚未见报道。

2.1.4 PDMSCs 骨髓是MSCs的主要细胞来源，而人类胎盘是更好的选择。首先，PDMSCs容易获得，不会引起伦理冲突；其次，也是最重要的一点，与骨髓相比，人类胎盘中可以分离出更多的干细胞；第三，人类胎盘具有较低的免疫原性。PDMSCs具有多向分化能力以及分泌多种细胞因子促进创面愈合的能力。将PDMSCs加海藻酸钠粉制成PDMSCs水凝胶，可以维持PDMSCs的活性和细胞相容性；将其覆盖于DFU患者创面，可以明显促进糖尿病患者创面愈合并改善创面状况[24]。PDMSCs促进糖尿病创面愈合的可能机制：一方面，PDMSCs通过诱导溃疡组织中的新生血管生成以及增加胶原蛋白生成，促进伤口愈合；另一方面，PDMSCs还可以分泌大量的血管生长因子，包括VEGF、干细胞生长因子（HGF）、bFGF、转化生长因子-β（TGF-β）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）等，促进溃疡的修复[25-26]。此外，糖尿病动物模型创面研究结果也表明，PDMSCs能显著改善缺血肢体的血流量、毛细血管密度和肢体功能，减少氧化应激和内皮损伤[27]。

2.2 自体干细胞 目前，干细胞移植的来源，主要以骨髓、外周血、脐带血为多。其中，又以自体干细胞移植为多。自体干细胞包括自体BMSCs、自体外周血干细胞和自体脂肪组织来源干细胞（ADSCs）。自体干细胞移植主要以自体BMSCs和自体外周血干细胞为多。

2.2.1 自体BMSCs 骨髓是获得MSCs最常见的组织之一，BMSCs不受免疫限制，不易被细胞毒性T细胞和自然杀伤(NK)细胞识别消灭，并且可以减少细胞毒性淋巴细胞的形成，介导创面局部免疫功能，通过免疫调节、分泌多种生长因子刺激细胞增殖和分化，改善DFU的微循环，促进DFU修复。因此，BMSCs移植是DFU的一种安全方法，具有较好的疗效。

体内实验研究表明， BMSCs无论是经创缘皮下移植还是经小腿肌内移植，都能够向皮肤受伤部位周边迁移，通过旁分泌生长因子，促进真皮成纤维细胞的增殖和迁移，通过增加血管生成因子IGF-1、EGF和白细胞介素-8，刺激血管生成和增加周围组织再生，促进细胞增殖，降低炎症反应，加速创面愈合；并可通过表达角化细胞特异性蛋白和细胞角蛋白，增强创面的再上皮化，促进大鼠糖尿病溃疡的愈合[28]。尤其是经小腿肌内移植后，在创面愈合的后期，VEGF的表达水平显著高于其他大鼠。临床研究也表明，BMSCs移植可促进患者血流重建和创面愈合，表明BMSCs可能是治疗DFU的可靠治疗方案[29]。

2.2.2 自体外周血干细胞 自体外周血干细胞移植已被提供给世界各地越来越多的患者，其操作并不复杂，易为患者所接受。在正常生理情况下，人体外周血干细胞含量很少，一般通过人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)来动员来自骨髓的外周血干细胞，促进其释放到外周血。这是干细胞移植治疗中动员干细胞的主要方法，也可用于外周血干细胞移植治疗下肢缺血性疾病。一般G-CSF给药后4～5 d，外周血CD34+细胞数量可达到动员前的40～80倍；然而，如果G-CSF停药1周，外周血CD34+细胞数量会逐渐恢复到基线水平[30]。此外，G-CSF可调动骨髓来源的内皮祖细胞(EPCs)进入外周血中，促进缺血区血管生成。近年来，随着血细胞分离技术的发展，促进骨髓造血干细胞进入外周血液中后对其进一步分离纯化成为可能。经过骨髓干细胞的释放、外周血细胞的分离和浓缩，可用于治疗的干细胞的浓度和数量显著增加。Xu等[30]研究发现，糖尿病足坏疽患者应用自体外周血干细胞后，其疼痛、患肢冷感、间歇性跛行、溃疡等症状明显改善；移植后1个月，激光多普勒扫描检测外周血流量幅值和血流灌注量较移植前明显改善；下动脉数字减影血管造影（DSA）成像显示新的侧支血管形成明显增加。这表明，应用自体外周血干细胞能极大地改善DFU的血运情况,增加患肢血流量，缓解患肢疼痛，促进创面愈合，是一种潜在的有效治疗方式。

2.2.3 自体ADSCs 脂肪组织传统上被认为是一种储能组织，由脂肪细胞、内皮细胞、成纤维细胞以及其他细胞组成。ADSCs可从人体脂肪组织中大量分离，与BMSCs相比，ADSCs具有在人体组织中含量丰富、不断更新，且易于分离、扩增快、低免疫原性等优点。从患者自身皮下脂肪组织中分离出来的ADSCs称为自体ADSCs。ADSCs也可以从同种的另一个个体或异种的脂肪组织中获得。研究表明，ADSCs具有增加肉芽组织形成和增强组织上皮化的能力，并释放体内生长因子， TGF -β1、TGF-β3 、VEGF、HGF、bFGF-2等，促进新生血管的形成[31-32]；还可通过增加创面胶原蛋白的分泌和沉积，参与受损组织再生；并刺激内皮祖细胞的增殖和分化，发挥免疫调节和抗炎的作用，促进DFU创面溃疡的修复[33]。因此，未来ADSCs移植可能是改善糖尿病患者足部溃疡的一种新策略。

3 总 结

干细胞来源丰富，增殖能力强，易于分离。移植的干细胞在一定条件下分泌大量细胞因子和生长因子，并可以分化成内皮细胞促进毛细血管形成，增加外周血供，促进创面愈合。MSCs对糖尿病足的改善涉及多种作用机制，如BMSCs通过促进胰岛β细胞功能改善胰岛素抵抗，并通过部分重建胰岛功能，有效改善2型糖尿病患者高血糖状况；在糖尿病早期输注MSCs不仅可促进胰岛β细胞分泌胰岛素降血糖功能，还可以减弱机体胰岛素抵抗，而晚期输注MSCs仅能减弱机体胰岛素抵抗[34]。自体干细胞由于具有免疫原性低、伦理问题较少、细胞来源丰富、易于分离提取等优势，成为一种很有前途的DFU治疗方法，但其具体机制尚不明确，其远期疗效还需长时间的观察研究。因此，未来需要进一步探讨如何优化干细胞治疗的程序，如确定最佳剂量、移植频率、移植途径以及干细胞的原始亚群。此外，干细胞移植治疗DFU的安全性和有效性还需要更大的样本量和更全面的临床试验来确定。