老鹳草乙醇提取物中黄酮类化合物和挥发性组分及其抗菌活性

李 宇，刘海华，刘翠君，由金文，赵仁君，石爱华，何美军 *

（1. 湖北省农业科学院中药材研究所，湖北 恩施 445000；2. 恩施职业技术学院，湖北 恩施 445000）

0 引言

【研究意义】抗生素滥用导致大量耐药菌如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林表皮葡萄球菌、多耐铜绿假单胞菌等病原菌出现，极大威胁人类健康。有文献报道全球每年约70万人死于耐药菌感染，预计到2050年死亡人数可达到1000万，仅在美国死于MRSA感染的人数就超过艾滋病和结核病的总和[1,2]。抗生素耐药性问题已成为威胁全球人类健康的紧迫问题，新型抗生素研发迫在眉睫。【前人研究进展】老鹳草（Geranium wilfordii Maxim）是老鹳草属（Geranium）植物，味辛、苦；性平；有祛风湿、通经络、止泻痢的功效；用于风湿痹痛、麻木拘挛、筋骨酸痛、泄泻痢疾等症[3]。现代药理研究发现老鹳草具有消炎抗氧化、降糖保肝等多种生理功能。鼠掌老鹳草（Geranium sibiricumL.）水煎液对经番泻叶水煎液处理的小鼠有止泻作用，对正常小鼠小肠运动有抑制作用，对推进机能亢进的小鼠小肠运动也有抑制作用[4]。老鹳草提取物可显著降低大鼠幽门结扎型、乙酸灼伤型、乙醇及吲哚镁辛诱导型的胃溃疡，能抑制幽门结扎型胃溃疡大鼠胃酸分泌、抑制胃蛋白酶活性[5]。野老鹳草（Geranium carolinianumL.）水浸提取液对玉米、花生和大豆都具有化感作用，其中对玉米的化感作用最大[6]。为进一步研究老鹳草的生理活性，已有学者从老鹳草中分离鉴定了13个具有多种生理活性的次级代谢产 物：β-谷 甾 醇、1,2,3,6-四-O-没 食 子 酰-β-D-葡 萄糖、短叶苏木酚羧酸、原儿茶酸、没食子酸、对羟基苯甲酸、胡萝卜苷、槲皮素、1,3,6-三-O-没食子酰-β-D-葡萄糖、老鹳草素和corilogin[7−10]。XU等[11]研究发现corilagin通过激活caspase-8、caspase-9、caspase-3和poly ADP-ribose聚合酶蛋白诱导胃癌细胞凋亡，corilagin能通过诱发胃癌细胞自噬（autophagy）和增加细胞活性氧（ROS）等方式抑制胃癌细胞生长。老鹳草素具有抗病毒、抗高血压、抗高血糖、保护肝脏、抗糖尿病和诱导细胞凋亡等多种生物活性，老鹳草素能通过抑制FAK/Src、ERK1/2途径衰减MMP-2的表达和活性，抑制口腔癌细胞SCC-9和SCC-14的迁移和入侵[12]。【本研究切入点】目前尚无文献报道老鹳草乙醇提取物对临床常见致病菌的抑菌活性、抑菌机理，以及老鹳草乙醇提取物的挥发组分、黄酮类化合物种类。【拟解决的关键问题】本研究拟鉴定恩施产区老鹳草乙醇提取物的挥发性组分和黄酮类化合物种类；检测恩施产区老鹳草乙醇提取物对12株临床致病菌肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、粪链球菌、枯草芽孢杆菌、藤黄微球菌、苏云金芽孢杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、多耐铜绿假单胞菌、大肠杆菌、溶藻弧菌、耐甲氧西林表皮葡萄球菌、鲍曼不动杆菌的最低抑菌浓度（MIC）值，以期为新型抗生素的研发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

老鹳草样品采集于湖北省恩施市华中药用植物园，经纬度坐标为109°45′24″ E，30°10′51″ N，经湖北省农业科学院中药材研究所高级农艺师由金文鉴定为老鹳草（G. wilfordii）。老鹳草是全草入药，所以本研究以老鹳草全草为研究对象。12株临床致病菌为：肺炎克雷伯（Klebsiella pneumoniaATCC 13883）、粪链球菌（Enterococcus faecalisATCC 29212）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、藤黄微球菌（Micrococcus luteus）、苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcusaureus）、多耐铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、溶 藻 弧 菌（Vibrio alginolyticus XSBZ14）、耐甲氧西林表皮葡萄球菌（Methicillin-resistant staphylococcus epidermidis）、鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumanniiATCC 19606）、大肠杆菌（Escherichia coliATCC 25922）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureusATCC 29213），由中国科学院热带海洋生物资源与生态重点实验室鉴定提供。Agilent 1260高效液相色谱仪（配DAD检测器），Phenomenex 色 谱 柱（50 mm × 4.6 mm, ODS 5 μm），imark酶标仪（Bio-Rad美国伯乐），Thermo Fisher世尔电导仪（型号：3-star），aglient Technologies 7890A/5975C GC-MS联用仪，RE-200A旋转蒸发仪（广州市星烁仪器有限公司），黄酮标准品杨梅苷、花旗松素、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖均购自阿拉丁试剂公司，其他试剂均为国产分析纯。

LB培养基配制：酵母提取物5 g·L−1，胰蛋白胨10 g·L−1，NaCl 10 g·L−1，pH 7.2～7.4，121 ℃灭菌30 min（固体LB培养基加入琼脂20 g·L−1）。

MH液体培养基配制：牛肉粉2 g·L−1，可溶性淀粉1.5 g·L−1，酸水解酪蛋白 17.5 g·L−1，pH 7.2～7.6，121 ℃灭菌30 min。

1.2 试验方法

1.2.1 老鹳草乙醇提取物获得 10 g新鲜老鹳草样品粉碎，为充分提取鞣质和黄酮类化合物，以60%乙醇溶液为提取溶剂[13]。料液比1∶50，250 mL乙醇溶液（60%）浸泡18 h，200 w超声浸提30 min。10 000r·min−1离心取上清，减压蒸馏得浸膏1.862 g，浸膏得率18.62%。

1.2.2 老鹳草乙醇提取物挥发性成分与黄酮化合物检测 气相色谱条件：agilent 19091S-433毛细管柱（HP-5MS 5% Phenyl Methyl Silox，30 m×250 μm）；升温程序：60 ℃保持2 min，5 ℃·min−1升至240 ℃，保持2 min，然后10 ℃·min−1升至280 ℃保持2 min，总运行时间23 min；进样口温度为250 ℃；载气为氦气（99.999%）；流速为1.8 mL·min−1；进样量为5 μL不分流。质谱条件：电子轰击（EI）离子源；离子源温度230 ℃；四级杆温度150 ℃；电子能量70 ev，接口温度250 ℃，质量扫描范围30～500 amu。检索谱库为NIST08.LIB标准谱库，匹配度≥900，鉴定为同一个化合物，运用面积归一化法计算老鹳草乙醇提取物各组分相对含量[14]。样品处理：老鹳草乙醇提取物用甲醇溶解，13 000 r·min−1离心10 min，吸取上清进样分析，以分析纯甲醇进样作空白对照组，每组样品重复进样3次。

高效液相色谱进样条件：时间0 ～20 min，A相95%～20%；时间20 ～25 min，A相20%～0%；时间25～27 min，A相0%～0%；时间27.1 ～30 min，A相95%～95%。A相：95%H2O、5%甲醇、0.1%乙酸，B相：100%甲醇、0.1%乙酸。老鹳草乙醇提取物用甲醇溶解，13 000 r·min−1离心10 min，吸取上清进样分析，以分析纯甲醇进样作空白对照组，每组样品重复进样3次。利用HPLC外标法[15]测定老鹳草乙醇提取物各黄酮组分含量，将3个标准品杨梅苷、花旗松素、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖配制成6个质量浓度梯度（1.0、2.0 、4.0 、8.0 、16.0 、32.0 μg·mL−1）的混标，测定仪器信噪比（S/N），当各标准溶液稀释至信噪比3＜S/N＜10时，以该溶液浓度计算仪器检出限（S/N=3）和定量限（S/N=10），得到3个标准品的标准曲线、R2、检出限和定量限。对各标准品进行精密度和重复性实验，每个混标重复检测6次，计算相对标准偏差（S）。检测加入标量的各样品的黄酮组分含量，计算回收率和相对标准偏差，重复检测6次。外标法检测老鹳草乙醇提取物中各黄酮组分的含量计算公式：

C：老鹳草样品中黄酮组分含量；n：HPLC检测浓度；m：老鹳草样品干重

1.2.3 老鹳草乙醇提取物抗菌活性测试 用滤纸片法[16]测试老鹳草乙醇提取物对12株临床致病菌的抑菌活性，取20 μL培养至OD600为0.6的测试菌菌液与20 mL LB固体培养基混合均匀倒平板。取5 μL老鹳草乙醇提取物（二甲基亚砜DMSO溶解）于滤纸片上，使滤纸片完全吸收，将滤纸片置于混有菌液的培养基上，另设氨苄青霉素（100 mg·mL−1）作阳性对照、DMSO作阴性对照，37 ℃培养12 h，测抑菌圈。37 ℃培养12 h，测抑菌圈。参照抗生素药敏标准：高敏（抑菌圈直径＞16 mm）、中敏（10～16 mm）、轻敏或耐药（＜10 mm）。采用微量肉汤稀释法测定老鹳草乙醇提取物对致病菌的MIC值，按美国临床和实验室标准化协会（CLSI）M07-A9[17]的标准操作程序，在12列8行规格的96孔板上依次添加以下内容：第3～12列的每孔加入含乙醇提取物样品的MH液体培养基100 μL，设置乙醇提取物终质量浓度分别为128.0、64.0、32.0、16.0、8.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0.25 mg·mL−1。第1列加入200 μL MH液体培养基， 第2列加入100 μL MH液体培养基（阳性生长组），将培养好的菌液稀释1000倍， 2～12每孔加入稀释菌液100 μL。另设氨苄青霉素（100 mg·mL−1）作药物阳性对照组。37 ℃培养16 h后使用imark酶标仪检测OD600，根据CLSI M100-S26[18]标准：与阳性生长对照管比较抑制80%细菌生长的药物浓度为受试菌的MIC值。

1.2.4 数据处理 所有试验数据运用SPSS 19.0 软件进行数据统计分析，试验数据以“平均值±标准偏差”表示。

2 结果与分析

2.1 老鹳草乙醇提取物分挥发性成分鉴定与相对含量测定

通过GC-MS分析共从老鹳草乙醇提取物中检测到223个离子峰，通过NIST08.LIB标准谱库检索，共从老鹳草乙醇提取物中鉴定出18个挥发性物质（表1），主要为脂肪烃（5.72%）、脂肪酸（17.09%）、生物碱（1.15%）。脂肪烃类化合物有6-methyloctadecane（0.56%）、2,6,10-trimethyltetradecane （0.62%）、octadecane （0.97%）、octacosane （1.85%）、（E）-3,7,11,15-tetramethylhexadec-2-en-1-ol （1.50%）、2-methylhexadecan-1-ol （0.52%）、10-octylnonadecane （0.32%）共8个（表1）。脂肪酸类化合物有docosyl docosanoate（0.42%）、methyl 11-（3-pentyloxiran-2-yl） undecanoate（0.96%）、（Z）-7-methyltetradec-8-en-1-yl acetate（0.92%）、methyl palmitate （7.91%）、palmitic acid（0.45%）、methyl （E）-octadec-9-enoate （4.93%）、methyl 12-methyltetradecanoate （0.53%）、oleic acid（0.97%）共8个，其中化合物methyl （E）-octadec-9-enoate、methyl （E）-octadec-9-enoate、oleic acid为不饱和脂肪酸（表1），饱和脂肪酸类化合物具有供应能量、增加胆固醇浓度及调节低密度脂蛋白（LDL）代谢等多种生理功能，不饱和脂肪酸类化合物具有降低胆固醇、调节血脂、降低血压、抗肿瘤、保护视力等多种生理功能[19]。

表 1 老鹳草乙醇提取物组分挥发性成分及其含量测定结果Table 1 Volatiles in G. wilfordii ethanol-extract

（5.β.）Pregnane-3,20.β.-diol,14.α.,18.α.-[4-methyl-3-oxo-（1-oxa-4-azabutane-1,4-diyl）]-, diacetate （1.15%）是首次在老鹳草乙醇提取物中鉴定的挥发性生物碱，生物碱具有抗肿瘤、消炎、抗病毒、抗血小板凝集、抗心律失常及抗高血压等重要生理功能[20]。

2.2 老鹳草乙醇提取物黄酮化合物鉴定与含量测定

通过HPLC检测得到黄酮标准品杨梅苷（Rt 16.498 min）、花旗松素（Rt 17.508 min）、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖（Rt 17.978 min）与老鹳草乙醇提取物中3个吸收峰（1） Rt 16.506 min、（2） Rt 17.503 min、（3） Rt 17.981 min保留时间一致（图1）。

黄酮标准品杨梅苷、花旗松素、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖与老鹳草乙醇提取物中3个吸收峰（1、2、3）的吸收光谱分别对应一致（图2），通过保留时间和吸收光谱数据鉴定这3个吸收峰分别为杨梅苷、花旗松素、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖。

HPLC外标法测量3个标准品的标准曲线、重复性、检出限、定量限如表2所示，线性相关性好（R2≥0.999 0）。通过配制本底含量标准品浓度溶液，加入定浓度的标准品，HPLC检测，获得标准品的加标回收率为98.56%～101.05%，相对标准偏差为0.55%～1.50%（表2）。

利用HPLC外标法检测老鹳草乙醇提取物各黄酮化合物含量：花旗松素（3.72 mg·g−1）、杨梅苷（2.56 mg·g−1）、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖（5.56 mg·g−1），加标回收率为99.24%～101.98%，相对标准偏差为0.85%～1.12%（表3）。

图 1 老鹳草乙醇提取物与黄酮标准品保留时间对比Fig. 1 Retention times of G. wilfordii ethanol-extract and flavonoid standards

图 2 老鹳草乙醇提取物与黄酮标准品光谱对比Fig. 2 Spectrograms on G. wilfordii ethanol-extract and flavonoid standards

表 2 标准曲线、重复性及检测限（means±SD，n=6）Table 2 Regression equation, correlation coefficient, and detection limit on measurements (means±SD, n=6)

2.3 老鹳草乙醇提取物抗菌活性粗筛

滤纸片活性测试结果显示老鹳草乙醇提取物对12株临床致病菌具有良好的抗菌效果，老鹳草乙醇提取物对粪链球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及鲍曼不动杆菌有高敏抑制活性（抑菌圈≥16 mm），其MIC值分别为1.0、1.0 、1.0 、2.0 mg·mL−1。对肺炎克雷伯菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、多耐铜绿假单胞菌、溶藻弧菌、耐甲氧西林表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌有中敏抑制活性（抑菌圈直径：11 ～15 mm），其MIC值分别为4.0 、4.0 、4.0 、4.0 、8.0 、4.0、4.0 mg·mL−1。对藤黄微球菌有微弱抑菌活性（抑菌圈≤10 mm），其MIC值为16.0 mg·mL−1（表4）。

表 3 老鹳草乙醇提取物各黄酮化合物含量表（means±SD，n=6）Table 3 Flavone contents in G. wilfordii ethanol-extract

表 4 老鹳草乙醇提取物的抗菌活性（means±SD，n=3）Table 4 Antibacterial activity of G. wilfordii ethanol-extract

3 讨论与结论

细菌耐药性问题的日益恶化和我国限抗和禁抗政策的落地，让抗生素替代品的研究越发迫切[21]。Kim等[22]学者曾用239种中草药乙醇提取物对7株多重耐药金黄色葡萄球菌的广谱抑菌活性进行系统评价，发现了74种中草药具有良好的抑菌活性，说明传统中草药来源的活性成分具有开发成为抗菌药物替代物的良好潜力。

老鹳草乙醇提取物被发现具有多种生物活性，对结肠癌细胞的增殖具有抑制作用[23]，能抑制幽门结扎型胃溃疡大鼠胃酸分泌、抑制胃蛋白酶活性[5,11]，对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、停乳链球菌、鸡沙门氏杆菌的抑菌效果良好[24]。老鹳草乙醇提取物的主要活性成分为鞣质类、黄酮类、有机酸和挥发油类化合物[25,26]，程小伟等[27]进一步研究发现老鹳草乙醇提取物中的山柰酚、没食子酸衍生物和黄酮类化合物对金黄色葡萄球菌具有较好的抑菌活性。 杨秀芳等从老鹳草属植物中共分离、鉴定了约39个鞣质类化合物、35个黄酮类化合、8个有机酸类化合物[28]。研究表明老鹳草中鞣质具有抗菌、抗病毒、抗氧化、降糖保肝等作用[29]。

本研究首次发现恩施地区老鹳草乙醇提取物具有优良抗菌活性和广谱性，对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、粪链球菌、大肠杆菌及鲍曼不动杆菌有高敏抑制活性，对肺炎克雷伯菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、多耐铜绿假单胞菌、溶藻弧菌、耐甲氧西林表皮葡萄球菌有中敏抑制活性。本研究首次鉴定了恩施地区老鹳草乙醇提取物的挥发成分主要为脂肪烃（5.72%）、脂肪酸（17.09%）、生物碱（1.15%）。首次测定了恩施地区老鹳草乙醇提取物中的3个黄酮类化合物的含量：花旗松素（3.72 mg·g−1）、杨 梅 苷（2.56 mg·g−1）、槲 皮 素-3-O-β-D-葡萄糖（5.56 mg·g−1）。

恩施地区老鹳草乙醇提取物具有优良抗菌活性和广谱性，为开发新型植物来源的抗生素提供了重要参考。但是老鹳草乙醇提取物中发挥抑菌功能的活性成分和抑菌机制，还有待进一步分析研究。