尖叶假龙胆对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用

付强，王晓雨，李冀

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

冠状动脉缺血性心脏病是指冠状动脉供血减少而心肌耗氧量不断增加，导致血液以及氧气的供需失衡引起的心脏疾病，治疗则主要是以恢复冠状动脉的血液灌注，有效减少缺血性心脏病的损伤为目的。然而研究发现心脏组织在恢复血液灌注后，会加重心脏组织的损伤，导致大量心肌细胞的死亡，损伤比灌注前更加严重，最终造成心脏的损伤，影响其整体功能。即出现心肌缺血再灌注损伤(Myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)这一现象。尖叶假龙胆，别名为苦龙胆，鄂伦春族和鄂温克族猎民称其为“稳心草”[1]，使用其全草泡水或者直接嚼服作为治疗以及预防心脏病的一种特效药物。武氏等[2]为阐述尖叶假龙胆抗心律失常的作用，对其主要成分雏菊叶龙胆酮(bellifolin)进行研究，实验证实bellifolin对大鼠心电图产生了影响，能够减慢心律，缩短P-R间期等。但对尖叶假龙胆含药血清的心肌保护作用尚未进行相关研究。因此，本实验建立在以往实验的基础上，旨在探讨尖叶假龙胆含药血清是否对MIRI的心肌具有保护作用。

1 实验材料

1.1 实验药材

课题所用药材购内蒙古根河市，经黑龙江中医药大学药学院药用植物教研室樊锐锋副教授鉴定尖叶假龙胆全草。样品标本储存在黑龙江中医药大学方药分析实验室。

1.2 实验动物

清洁级雄性SD大鼠30只，体质量(220±20)g，购于黑龙江中医药大学动物实验中心，动物合格证号为：SCXK(黑)2013-2014。饲养环境：自由饮食、饮水，温度(23±2)℃；相对湿度(55±15)%；实验室风速：0.1～0.2 m/s。

1.3 仪器与试剂

Langendorff灌流设备、BL-420生物机能实验系统(成都泰盟科技有限公司)；Glmour 2000型全自动生化仪(美国M.D.仪器公司)；多功能酶标仪(瑞士TECAN公司)；H-500型透射电子显微镜(日本日立公司)；2135型切片机(德国莱卡公司)；Moticam3000显微摄影成像系统、Motic image advanced 3.2病理图像分析系统(麦克奥迪实业集团有限公司)；CAT、MDA、IL-1β、TGF-β试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.4 溶液的配制

KH液的配制(pH7.4，37 ℃)：NaCl 120 mmol/L，KCl 4.7 mmol/L，KH2PO41.2 mmol/L，MgSO41.2 mmol/L，NaHCO325 mmol/L，CaCl21.25 mmol/L，Glucose 11 mmol/L。氧饱和KH液中混入95% O2和5% CO2；缺氧KH液中混入95% N2和5% CO2。

2 实验方法

2.1 实验分组以及给药情况

30只SD大鼠随机分为3组，每组10只，分组情况以及给药处理情况如下。

(1)正常对照组(Control组):取出心脏后，置于Langendorff装置上，给予氧饱和的KH液持续灌流30 min稳定后，继续给予氧饱和的KH液持续灌流150 min。

(2)心肌缺血再灌注损伤模型组(I/R组)：取出心脏后，置于Langendorff装置上，给予氧饱和的KH液持续灌流30 min稳定后，给予缺氧KH液灌流30 min，给予氧饱和的KH液120 min。

(3)尖叶假龙胆组(I/R+GEN组)：取出心脏后，置于Langendorff装置上，给予氧饱和的KH液持续灌流30 min稳定后，给予缺氧KH液灌流30 min，给予混有浓度3 g·kg-1·h-1尖叶假龙胆氧饱和的KH液120 min。

2.2 药材提取与制备

使用75%乙醇浸泡干燥尖叶假龙胆全草(二者体积比为10:1)，常温浸泡5 h后，加热至55 ℃回流1 h，继续加入75%乙醇，加热回流1 h，过滤，两次的滤液合并，减压干燥回收乙醇，浓缩至1 g·mL-1。根据各组给药剂量进行配比。

2.3 造模方法

造模方法参考徐淑云[3]、张昱[4]文献报道进行，整个过程要求操作迅速。然后根据不同组别给予不同的灌注方案。

2.4 指标检测

2.4.1 心肌组织的病理形态学影响

再灌注结束后，迅速解剖取出大鼠心脏，用预冷的PBS液将表面清洗干净，并去除心脏上的脂肪组织以及结蹄组织，用滤纸吸干，沿着心肌纤维方向切取大鼠心尖部位5 mm的心肌组织，将其切成大约1 mm×1 mm×2 mm的小块，放入 4%戊二醛固定液中，在4 ℃冰箱中贮存过夜。依次经过脱水、浸透、包埋、切片、电子染色，最后透风自然晾干后置于透射电子显微镜下观察并拍照。

2.4.2 CK-MB的含量测定

再灌注结束后收取冠脉流出液，放入-80 ℃冰箱内冻存备用，测定前37 ℃水浴，根据CK-MB试剂盒说明书对冠脉流出液中二者含量进行测定，上全自动生化仪，在340 nm波长出测定各组吸光度值，测定各组中CK-MB的含量变化。

2.4.3 心肌组织中丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)、白细胞介素(IL-1β)、转化生长因子(TGF-β)的测定

再灌注结束后，用预冷的PBS液(pH7.4)将表面清洗干净，并去除心脏上的脂肪组织以及结缔组织，用滤纸吸干，切下左心室部分心肌组织，称重。放入PBS(pH7.4)中，部分用液氮保存备用，部分准备制作心肌组织匀浆。按照组织与冰生理盐水1:9的比例倒入生理盐水，在冰水浴的条件下制作组织匀浆，首先使用电动玻璃匀浆机制备出心肌组织匀浆，用低温离心机(参数为：温度为4 ℃，3 500 r/min)进行离心15 min，吸取离心后的上清液，分装在EP管中-80 ℃冰箱保存备用。按照南京建成生物工程研究所的MDA、CAT、IL-1β 、TGF-β试剂盒说明进行操作。

2.5 统计学分析

3 实验结果

3.1 CK-MB含量的变化

与Control组比较，I/R组、I/R+GEN组大鼠心肌组织中CK-MB含量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与I/R组比较，I/R+GEN组CK-MB含量显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。结果见表1、图1所示。

表1 尖叶假龙胆对心脏冠脉流出液CK-MB含量的影响

图1 尖叶假龙胆对心脏冠脉流出液CK-MB含量的影响

3.2 各组中CAT活性的变化情况

与Control组比较，I/R组、I/R+GEN组大鼠心肌组织中CAT活性明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；与I/R组比较，I/R+GEN组CAT活性显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。结果见表2、图2所示。

表2 尖叶假龙胆对心肌组织CAT活性的影响

图2 尖叶假龙胆对心肌组织CAT活性的影响

3.3 各组中MDA含量的变化情况

与Control组比较，I/R组、I/R+GEN组大鼠心肌组织中MDA含量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与I/R组比较，I/R+GEN组MDA含量明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。结果见表3、图3所示。

表3 尖叶假龙胆对心肌组织MDA含量的影响

图3 尖叶假龙胆对心肌组织MDA含量的影响

3.4 各组中IL-1β含量的变化情况

与Control组比较，I/R+GEN组IL-1β含量变化不明显，差异无统计学意义(P>0.05)；与I/R组比较，I/R+GEN组IL-1β含量明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。结果见表4、图4所示。

表4 尖叶假龙胆对心肌组织IL-1β含量的影响

图4 尖叶假龙胆对心肌组织IL-1β含量的影响

3.5 各组中TGF-β含量的变化情况

与Control组比较，I/R组、I/R+GEN组大鼠心肌组织中TGF-β含量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与I/R组比较，I/R+GEN组TGF-β含量明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。结果见表5、图5所示。

表5 尖叶假龙胆对心肌组织TGF-β的影响

图5 尖叶假龙胆对心肌组织TGF-β含量的影响

3.6 心肌组织超微结果

Control组：心肌肌节纤维排列规则，线粒体以及肌节间结构清晰，基质密度均匀；I/R组：表现为心肌肌节纤维排列紊乱，肌丝发生溶解甚至断裂。心肌细胞细胞核和线粒体都损伤，线粒体肿胀，嵴结构出现断裂，染色质浓缩，形成大小和形状不一的碎片及块状；I/R+GEN组：心肌肌节纤维排列相对规则，各结构清晰，损伤的心肌超微结构有所改善。结果如图6所示。

4 讨论

尖叶假龙胆是龙胆科一年生草本植物,又名苦龙胆,蒙药名为阿古特-其其格,广泛分布于我国河北、黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古、山西等地区。其全草入药,味苦、性凉,具有清热、利湿的功效,临床可用于治疗黄疸性肝炎、头痛、发烧等。敖鲁古雅鄂仑春族猎民长期用其治疗心绞痛等疾病,疗效极为显著[5]。

心肌酶学的改变可以判断心肌发生损伤的程度，CK-MB是肌酸激酶CK的同工酶，其在心肌组织中的变化特异性较高，故其是检测心肌是否发生坏死的黄金指标。多项研究结果表明，心肌缺血再灌注发生过程中伴随着大量的氧自由基(ROS)爆发式产生[6]。丙二醛(MDA)是体内氧自由基攻击生物膜中的多价不饱和脂肪酸发生脂质过氧化的终产物。丙二醛作为测定脂质过氧化的程度的指标之一[7]，也间接反映出ROS对心肌细胞的损伤程度[8]。过氧化氢酶(CAT)活性的变化可反映机体清除ROS、抗氧化损伤的能力。心肌细胞中炎症因子IL-1β的变化是判断心血管疾病损伤程度的指标[9]。转化生长因子(TGF-β)可以使心肌细胞免受IL-1β的损伤，其机制可能与其对IL-1β诱导的NO抑制作用相关。

本研究表明，与Control组比较：I/R组、I/R+GEN组大鼠心肌组织中CK-MB含量明显升高，证明模型制备成功，造成了心肌损伤的发生；I/R组体现脂质过氧化的程度MDA含量显著升高，抗氧化损伤指标CAT活性显著下降，说明造模成功后，心肌损伤严重，有氧化应激反应的参与；相关炎细胞因子IL-1β、TGF-β含量升高，在尖叶假龙胆干预后，各组炎症因子含量降低，证明心肌损伤得到修复，炎症反应减弱，尖叶假龙胆对心肌缺血再灌注损伤具有修复和保护作用。

与I/R组比较，I/R+GEN组CK-MB含量显著降低，证明尖叶假龙胆能够减轻心肌缺血再灌注造成的损伤；CAT活性显著升高，MDA含量降低，证明尖叶假龙胆能够抑制氧化应激水平对心肌起到保护的作用。

超微结构说明心肌缺血再灌注损伤能引起大鼠心肌细胞凋亡，发生凋亡特征性的形态学改变。尖叶假龙胆组对心肌缺血再灌注损伤心肌组织具有保护作用。

5 结论

综上所述，与I/R组比较，尖叶假龙胆组可以使冠脉漏出液中的CK-MB含量明显降低；使心肌组织中MDA、IL-1β、TGF-β含量明显降低，CAT活性明显升高，差异具有统计学意义；有效改善心肌组织的超微结构。说明尖叶假龙胆组能够抗心肌缺血再灌注造成的损伤，对心肌具有保护作用。