沙眼衣原体实验室检测技术及筛查策略研究进展*

周可，韩燕，尹跃平

(中国医学科学院北京协和医学院皮肤病研究所，南京 210042)

沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis，Ct)是目前常见的性传播疾病病原体之一。世界卫生组织(WHO)估计每年新增Ct感染人数达1.3亿[1]。美国2017年报告170万例生殖道Ct感染[2]。自2008年，我国在105个性病监测点将生殖道Ct感染列为单独的一种性病进行监测，2008—2015年平均感染率为32.48/10万～37.48/10万，年增长率达1.95%[3]。Ct感染后有50%～70%的患者无明显临床症状，女性则达70%～80%[4]。然而，无论症状性感染和无症状感染都会导致后遗症，主要影响女性生殖系统，可能出现盆腔炎、异位妊娠和输卵管不孕[5]。此外，Ct与人乳头瘤病毒和HIV的感染有关[4]。由于Ct目前仍缺乏有效疫苗，因此对Ct的防治主要依赖于早期筛查、早诊断和早治疗,选择高效的实验室检测诊断方法对控制Ct感染具有重要的影响。本文就Ct检测方法及检测策略进展进行综述。

1 检测方法的进展

1.1病原学检测进展 目前，对于Ct的病原学检测主要包括直接涂片法、细胞培养法、抗原检测法和核酸检测法。直接涂片法应用于眼部感染标本的敏感性可达95%，但用于泌尿生殖道Ct感染的诊断时其敏感性和特异性均低[6]。细胞培养法被公认是检测Ct感染的金标准，是检测衣原体活体唯一的实验方法，但该方法敏感性受标本采集、储存、运输以及污染的影响较大。目前细胞培养法在诊断实验室很少被使用，但在涉嫌性侵犯需要进行高特异性的测试时仍然使用这种方法[7]。随着衣原体抗原特异性单克隆抗体的发现，抗原检测方法主要包括酶免法(EIA)、直接免疫荧光法(direct immunofluorescence assay, DFA)和免疫层析法(immunochromatography assay，ICA)，常用的抗原是Ct的主要外膜蛋白(major outer membrane protein，MOMP)、热休克蛋白60(heat shock protein 60,HSP60)和脂多糖(LPS)。EIA法因操作简便、可自动化判读，适宜标本筛查。DFA法适用多种标本，具有敏感、特异、快速的优点，但由于判读受主观因素影响，且荧光标记物不稳定，不适宜标本筛查。ICA法因操作简单，省时快捷，对场地和设备要求低，目前在我国临床上仍被广泛应用。

检测微生物的核酸检测(nucleic acid tests, NATs)技术主要有2种类型：培养确认NATs技术和直接NATs技术。临床Ct检测主要采用直接NATs技术，其准确性高于直接免疫学检测方法。美国食品药品管理局批准的第一个非放射性直接NATs试剂是Gen-Probe PACE试剂。但直接NATs技术的灵敏度远不如随后开发的加入目标基因扩增技术(nucleic acid amplification tests, NAATs)，随后NAATs逐渐被认为是Ct的首选检测方法，并已取代培养成为诊断金标准[8]。NAATs可根据其检测的核酸物质分为DNA扩增和RNA扩增。DNA扩增主要选择位于MOMP的omp1基因、隐蔽质粒靶基因；因瑞典的Ct新变种(new variant of CT, nvCT)的广泛流行[9-10]，随后增加可以保证检测到nvCT的主要外膜蛋白OmpA保守序列的靶基因。采用环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)以及金纳米探针(AuNP)的比色法鉴定法检测Ct，其敏感性高，可检测低至11.25拷贝的目标DNA[11]。而RNA扩增主要基于RNA转录介导扩增技术(transcription mediated amplification, TMA)对Ct的23S rRNA进行扩增与检测[12]。也可以选用Ct染色体基因作为Ct的靶基因进行实时定量PCR检测[13]。因每个感染细胞都含有大量的rRNA，TMA需要的设备为具有实时定量功能恒温扩增仪，整个实验过程不需要调节温度，操作过程较为简单[14]。英国Twistdx公司开发了一种等温重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification, RPA)方法，该方法能在15 min内检测沙眼衣原体(Ct)/淋球菌(NG)感染，不需要热循环，电池供电，反应温度为37 ℃。研究者选用男女不同标本评价基于15 min运行时RPA检测Ct和NG原型的准确性，使用常规临床Ct/NG核酸扩增试验作为对照，用Cepheid Ct/NG GeneXpert解决差异，结果发现除男性尿标本Ct特异性99.7%、阳性预测值97.1%外，其他标本类型的2种病原体的特异性和阳性预测值均为100%，故认为该检测试验具有优良的性能特点，可与目前使用的NAATs相媲美，并基本符合WHO标准[15]。Chernesky等[16]对目前市场4种商业核酸检测试剂使用情况进行比较，发现GeneXpert Infinity 80因其检测时长短，维护时间短，消耗较少而更具优势，见表1。

可以通过保持标本的低温和尽量缩短标本采集和处理之间的时间来维持标本中Ct的生存能力。抗原检测所需的标本主要是尿道拭子和宫颈拭子，NAATs除了可选用尿道拭子和宫颈拭子，还可用尿液和阴道拭子等无创性标本。根据女性人群筛查条件不同，选用阴道拭子还是宫颈拭子，依据检查方式而定。Schachter等[17]研究表明阴道拭子标本是感染筛查的首选标本，但有症状的妇女需要进行盆腔检查，同时采集宫颈标本。Nelson等[18]对使用不同女性标本进行NAATs检测的准确性进行系统分析，得出阴道拭子(临床采集或自采)以及宫颈拭子均优于尿液检测结果的准确度(见表2)。对于男性人群，Chernesky等[19]对男性尿道拭子和首段尿标本用NAATs进行评价，结果显示无论有无症状，尿液即可达到检测要求，因此首段尿可以适用于男性人群的筛查。人群的干预项目需要招募更多人群参与，自采标本可以节省大量的人力和物力。Alexander等[20]对同时检测咽部和直肠部Ct感染无症状男性同性恋(men who have sex with men，MSM)人群自采标本与临床采集标本的性能进行评价，结果显示自采直肠拭子与护士采集直肠拭子并无明显差异，而在自采和护士采集的咽部拭子间敏感性无差异但特异性差异显著，部分自采标本出现假阳性，这可能与患者处理标本不当导致污染有关。运输自采的干燥拭子，能够扩大Ct的检测服务范围。Gaydos等[21]对邮递的干燥拭子以及保存于保存液中拭子进行比较，结果证实所有配对干拭子和湿拭子均能检测到Ct。

表1 不同核酸检测平台完成96份样本所耗费时间的比较

表2 不同样本采集方式NAATs检测的准确性[18]

1.2血清学检测 检测血清中Ct抗体的方法已有数十年历史，然而，由于与其他衣原体的交叉反应而受到限制。随着新的敏感特异的血清学检测方法的发展，新的Ct血清学检测有助于提高对Ct流行病学和预防的认识。Budrys等[22]研究发现Ct抗原中的HSP60、CT376、CT557和CT443分别与稀释血清样本结合检测后，可区分输卵管因素不孕的妇女和具备正常生育能力的妇女，敏感性为63%(95%CI：0.41～0.77)，特异性为100%(95%CI：0.91～1)，这些抗原被指定为输卵管因子不孕相关抗原，但不能用于区分输卵管因素不孕患者和急性感染患者；而Ct抗原中的CT875和CT147可以检测暴露于Ct人群中发生急性感染的妇女，其检测敏感性为63%(95%CI：0.41～0.77)，特异性为100%(95%CI：0.95～1)，因此，CT875和CT147被指定为急性感染相关抗原；可以使用不同的Ct抗原的连续筛查来鉴别输卵管因素不孕、正常生育和急性感染的妇女，并且抗原片段化和血清稀释可以进一步提高检测的敏感性和特异性。Rahman等[23]对11种Ct肽抗原IgG1、IgG3和IgA1抗体的检测结果与4种商品试剂结果进行比较，发现所有11个肽检测结果敏感性均高于商品试剂，其中5个最佳肽的组合敏感性为86.5%。Ct的血清学检测将来可以应用于生殖道Ct控制项目评估、新的疫苗候选者评估，作为盆腔炎、输卵管不育的单独或组合生物标记物检测[24]。

2 筛查策略进展

WHO在2016年全球“Towards Ending STIs”战略中提出，将“广泛筛查”作为2016—2030年降低90%性传播疾病发病率的一个关键组成部分。对Ct进行筛查已被证明可以降低盆腔炎以及宫颈癌的发病率[25]。美国疾病控制和预防中心(CDC)明确提出对于非孕期及孕期妇女的筛查策略，建议对于年龄<25岁、有新的或多个性伴侣、伴侣患有性传播疾病、既往患有性病(如衣原体感染、淋病、梅毒或滴虫病等)、目前诊断其他性传播疾病(淋病、梅毒或滴虫病等)、怀孕、从事商业性工作、监禁等情况的妇女进行Ct筛查[26]。虽然Ct流行率数据为制定有针对性筛查的行为准则提供了依据，但对妇女发生性关系的男子的控制方案定义尚未达成共识。虽然没有对异性恋男子进行筛查的建议，但美国预防服务工作组(U.S. Preventive Services Task Force, USPSTF)2014年建议，在Ct感染高发的临床环境(如性病诊所、青少年诊所、拘留和教养设施)和进入武装部队或国家就业培训方案的人员中性活跃的异性恋男子应给予检测。Ct和淋球菌感染在某些人群(如MSM)的生殖器外部位很常见，而且大多数感染均无症状，因此建议每年对MSM人群生殖器外部位进行常规筛查，但目前没有关于女性生殖器官外常规筛查的建议[27]。在英国，早在2003年就提出确保所有25岁以下的性行为活跃者都了解衣原体，并获得性健康服务，以减少感染风险或传播。英格兰公共卫生组织建议性活跃人群应每年予以Ct检测，在不同环境中更换性伴侣的情况下应予以检测[28]。2005年，澳大利亚政府认识到年轻人感染衣原体的公共卫生问题，并将检测作为降低感染率的国家战略[29]。在欧洲有证据显示Ct监测系统已取得进展[30]。目前，在我国深圳启动了“淋病和生殖道沙眼衣原体综合防治”项目，旨在探索中国生殖道Ct感染的防治策略。

即便诊断性能优越的NAATs仍存在延迟报告结果时间的情况，从而可能导致无法及时提供治疗。此外，虽然临床根据症状干预可以提供即时治疗，但大多数Ct感染无症状，使得临床漏诊了大多数Ct感染者。因此，临床检测及大规模筛查需要床旁检测(point-of-care tests，POCTs)，以允许在同一次访问中作出诊断和治疗决定，确保即时治疗并防止后续治疗的损失。2006年，WHO提出了在一级健康中心使用POCT的“ASSURED”标准，随着新技术的不断开发进阶为REASSURED原则，即增加至9个方面(real-time connectivity, ease of specimen collection and environmental friendliness, affordable, sensitive, specific, user-friendly, rapid and robust, equipment free, deliverable to end-users：实时性，样本简单及环保获得、经济负担；敏感性；特异性；便利性；时效性；免仪器操作以及运输条件)，尽管在梅毒、衣原体、淋球菌感染和滴虫的POCT方面取得了显著进展，但截至目前，还没有完全符合所有这些标准的诊断试验[31]。用于Ct检测的POCT根据检测方法不同分为抗原检测和核酸检测，以基于抗原的POCT检测方法的敏感性较低，仅为11.6%～27.3%[32]；基于核酸的POCT方法是建立在封闭体系中进行实时PCR的基础上以完全自动化的方式进行，大约需要90 min得到结果[33]。Kelly等[34]对POCT在Ct检测中的应用进行系统评价，对9项涉及8种抗原POCT的研究和2项核酸POCT研究评价后得出，抗原检测对宫颈拭子、阴道拭子和男性尿液的总敏感性分别为53%、37%和63%，特异性分别为99%、97%和98%；核酸检测对所有标本类型的敏感性和特异性分别98%和99.4%。因此，Ct抗原检测POCTs虽然使用方便，但缺乏足够的敏感性，可推荐作为一种筛查试验，而NAAT因造价以及出结果时间较长限制其使用。

3 展望

Ct的检测方法对于发现Ct感染者有着重要价值，而目前基于抗原检测的方法敏感性较低，不利于有效地发现感染者；基于核酸检测的方法敏感性高，但是患者需要等待结果的时间长，不利于及时地控制感染者；有关针对血清学检测方法的研究目前正广泛地开展。Ct的筛查策略可以促进人群的自我检测和医生的筛查意识，但因费用效益比的问题，如何制定合适的人群筛查策略，现在仍需要进一步的研究和探索。