脑血栓患者血清中蛋白激酶C、核转录因子-κB水平与疾病严重程度及预后的关系*

琚冬梅， 饶雷萍， 邱茜茜， 方慧

1焦作煤业(集团)有限责任公司中央医院神经内科(河南焦作 454000)； 2郑州大学第一附属医院神经科(河南郑州 450052)

据WHO统计，2016年全球因脑血管疾病死亡人数在全球死亡人数中排位第三[1]。脑血栓是一种临床常见脑血管疾病，多由动脉粥样硬化斑块引起，好发于50岁以上中老年群体，易复发且极易留下后遗症，严重影响患者生活质量[2]。研究报道，脑血栓形成与年龄、血压、血脂、血清脂蛋白相关磷脂酶、同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)水平等指标密切相关，脑血栓是一类由多因素共同作用的复杂疾病，但关于脑血栓形成具体发病机制尚不完全清楚[3]。核转录因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)是一种机体内广泛存的转录因子，可直接调控多个靶基因。蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)是NF-κB下游蛋白分子。PKC-α是PKC家族中重要成员，研究发现PKC-α可激活NF-κB，参与不同原因引起的机体组织损伤及炎性反应[4]。研究表明，炎症反应可促进急性动脉粥样硬化性脑梗死疾病的发生、发展[5]，因此本研究拟观察血清PKC-α、NF-κB水平变化，探究其与动脉粥样硬化性脑血栓形成(atherosclerotic cerebral thrombosis，ACT)严重程度及ACT患者预后的关系。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 采用回顾性分析选择2016年4月至2018年9月本院收治动脉粥样硬化性脑血栓形成(ACT)患者226例为疾病组研究对象，男157例，女69例，年龄40～82岁，平均(66.72±10.95)岁，吸烟者76例，饮酒者35例，高血压者125例，糖尿病者78例。根据美国国立卫生研究院卒中量表(National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS)记录患者72 h内NIHSS评分，分为轻度组(NIHSS<4，n=70)、中度组(4≤NIHSS<10，n=113)、重度组(NIHSS≥10，n=43)。根据改良版Rank量表记录受试者90 d mRS评分，分为非致残组(mRS<3，n=122)和致残组(mRS≥3，n=104)。另取同期正常健康体检者226例为对照组，男142例，女84例，年龄40～81岁，平均(65.84±10.63)岁，吸烟者64例，饮酒者27例，高血压者85例，糖尿病者53例。两组患者性别、年龄、吸烟、饮酒者、基础疾病比例(高血压∶糖尿病)比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。收集所有患者临床检查资料，本研究经过本院道德伦理委员会批准通过，所有样品采集及资料调查均取得患者及其家属知情同意并签字确认，符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》。

1.2 纳入排除标准 参照第4届全国脑血管病学术会议通过的诊断标准(各类脑血管病诊断要点)并修改[6]：(1)多数ACT患者无明显头痛和呕吐；(2)常于安静状态下发病；(3)病程多呈缓慢逐渐进展或阶段性进行，多与脑动脉粥样硬化有关；(4)CT、MRI或血管造影检查发现脑血栓栓塞部位。

纳入标准：(1)符合脑血栓诊断标准并经CT或MRI检查确诊；(2)年龄>40周岁；(3)患者发病后就诊时间不超过72 h；(4)临床检查资料及随访资料完整。

排除标准：(1)脑出血或急性脑梗死患者；(2)肝、肾等脏器功能障碍者；(3)并发恶性肿瘤或血液疾病者；(4)不自愿配合调查研究者。

1.3 主要试剂及仪器 蛋白抽提试剂盒(批号：P0028)、BCA蛋白定量试剂盒(批号：P0010S)、兔源PKC-α(货号：AF1576)均购自上海碧云天有限公司；兔源NF-κB抗体(货号：LF-MA0236)GAPDH抗体(货号：AM4300)，二抗羊抗兔IgG(货号：15135)均购自美国Invitrogen。MODEL550型酶标仪。

1.4 方法

1.4.1 样本采集 采集受试者空腹外周静脉血5 mL，3 000 r/min 有效离心半径10 cm，离心10 min，留取血清，置于-70℃待检。

1.4.2 血清PKC-α、NF-κB蛋白水平检测 采用蛋白抽提试剂盒提取血清总蛋白，BCA试剂盒检测蛋白浓度，置于-80℃保存备用。取60 μg蛋白样品，80 mV电压下6% SDS-PAGE电泳2 h，250 mA下PVDF膜转膜70 min。5%脱脂奶粉室温封闭1.5 h，加入含2%脱脂奶粉的PBS稀释，添加一抗(PCK-α、NF-κB抗体 1∶500；GAPDH抗体1∶500)4℃孵育过夜，TBST缓冲液洗膜3次，20 min/次，用适量含2%脱脂奶粉的PBS稀释辣根过氧化物酶标记的二抗IgG(1∶5 000)室温孵育1.5 h，按上述方法洗膜，用免疫印记化学发光试剂(ECL)显色，数字化多功能图像增强化学发光系统曝片，观察结果并进行分析。

1.4.3 生化指标检测 采用日立7600全自动生化检测仪分析所有受试者血清总胆固醇(total cholesterol，TC)、高敏C反应蛋白(high sensitivity C reactive protein，hs-CRP)水平，采用循环酶法检测血清Hcy水平，采用免疫比浊法检测血清D-二聚体水平。

1.5 随访 患者治疗出院90 d进行电话护门诊随访，参照患者改良RANKIN量表(Modified Rankin Scale，mRS)评分0～2分为预后良好(非致残组)；mRS评分3～6分为预后不良(致残组)。

2 结果

2.1 疾病组与对照组患者的实验室检查结果比较 疾病组血清TC、Hcy、hs-CRP、D-二聚体水平显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 疾病组与对照组患者的实验室检查结果比较

注：*M(P25，P75)

2.2 轻、中、重度组ACT患者血清PKC-α、NF-κB蛋白水平及NIHSS评分比较 与轻度组比较，中度、重度组ACT患者血清PKC-α、NF-κB蛋白依次增加，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1、表2。

图1 Westenblot检测轻、中、重度组ACT患者血清PKC-α、NF-κB蛋白水平

2.3 致残组与非致残组ACT患者血清PKC、NF-κB蛋白水平及mRS评分比较 与非致残组比较，致残组患者血清PKC、NF-κB蛋白水平显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2、表3。

2.4 ACT患者血清PKC-α、NF-κB蛋白水平与NIHSS、mRS评分的相关性分析 Pearson相关性分析结果显示，ACT患者血清PKC-α、NF-κB蛋白水平与NIHSS、mRS评分均呈正相关(P<0.05)，见表4。

2.5 logistic分析影响ACT患者不良预后的危险因素 以ACT患者预后结局为因变量，以年龄、糖尿病、高血压、血清Hcy、TC、hs-CRP、D-二聚体、PKC-α、NF-κB蛋白水平为自变量多因素回归分析，结果发现，糖尿病、高血压、血清高Hcy、PKC-α、NF-κB蛋白水平是ACT患者不良预后的危险因素(P<0.05)。见表5。

3 讨论

动脉粥样硬化是导致脑血栓形成的高发危险因素之一，可导致患者颈动脉管腔狭窄、动脉血液循环障碍、血管狭窄部位栓塞，并进一步引发患者不同程度脑卒中[7]。而炎症反应在动脉粥样硬化发生、发展中具有重要推动作用，越来越多专家学者认为，动脉粥样硬化性脑血栓形成是中慢性炎症反应疾病[5，8]。研究报道，高血压与动脉粥样硬化互为因果，而糖尿病和高脂血症可加速动脉粥样硬化进程[9]。hs-CRP是炎症反应标志指标，健康人血清中含量很低且合成速度慢，机体出现组织损伤或炎性反应时，血清hs-CRP水平会急剧上升[10]。有研究认为，动脉粥样硬化性脑梗死患者多合并高血脂，可引起脂代谢紊乱，增加血液黏稠度，形成斑块阻塞血管，最终导致患者出现脑血栓等其他严重心血管疾病[11]。本研究结果发现，与对照组比较，ACT患者高血压、糖尿病比例增加，血清TC、Hcy、hs-CRP、D-二聚体水平显著升高，提示高血压、糖尿病、高血脂等并发症可能影响ACT发生、发展，ACT可能与机体炎症反应有关，ACT发生、发展可能促进Hcy、hs-CRP、D-二聚体等炎性指标水平增加。

表2 轻、中、重度组ACT患者血清PKC-α、NF-κB蛋白水平及NIHSS评分比较

注：*M(P25，P75)

图2 Westenblot检测致残组与非致残组患者血清PKC、NF-κB蛋白水平

表3 致残组与非致残组ACT患者血清PKC、NF-κB蛋白水平及mRS评分比较

注：*M(P25，P75)

表4 ACT患者血清PKC-α、NF-κB蛋白水平与NIHSS、mRS评分的相关性

表5 logistic回归分析影响ACT患者不良预后的危险因素

李建华等[4]研究报道，PKC是细胞信号转导机制中重要信号分子，其活化后可激活PCK-NF-κB信号通路，导致TNF-α等多种炎性介质产生，参与胰腺炎肝损伤过程，与正常对照组大鼠比较，胰腺炎组大鼠肝脏组织中PCK-α、NF-κB mRNA及蛋白水平具能显著增加。PKC是一类丝/苏氨酸蛋白激酶，可作为一种重要信号分子，不仅在炎性反应中发挥重要作用，还参与多种中枢神经系统病理生理过程，PKC激活是介导脑损伤极为关键的环节[12]。Song等[13]研究表明，醛糖还原酶抑制剂比尼尔和唑泊司他可通过调节ROS/PCK依赖的NF-κB和MAPK信号通路抑制乙型淀粉样蛋白诱导的阿尔兹海默病患者神经炎症，与对照组比较，比尼尔和唑泊司可显著下调PCK-α、NF-κB蛋白表达水平。本研究结果发现，与轻度组比较，中度、重度ACT患者血清PCK-α、NF-κB蛋白水平依次升高，且与ACT患者神经功能缺损NIHSS评分呈正相关，提示血清PCK-α、NF-κB蛋白水平升高可能与ACT发生及严重程度有关。本研究结果还发现，与非致残组比较，致残组患者血清PCK-α、NF-κB蛋白水平显著升高，且与ACT患者90 d mRS评分呈正相关，提示血清PCK-α、NF-κB蛋白水平升高可能与ACT患者不良预后有关。

汤永健等[14]研究报道，血清Hcy水平与缺血性卒中患者颈动脉粥样硬化斑块形成及神经功能缺损程度有关。刘洪娟等[11]研究报道，高血压、糖尿病、TC、CRP、Hcy是急性缺血性脑卒中患者颈动脉粥样硬化发生的危险因素。王强等[15]研究报道，脑组织IL-1β、TNF-α与NF-κB蛋白水平均显著升高，均与创伤性脑出血患者预后呈负相关。本研究结果发现，糖尿病、高血压、血清高Hcy、PCK-α、NF-κB蛋白水平是ACT患者不良预后的危险因素，提示监测血清Hcy、PCK-α、NF-κB蛋白水平可能对ACT患者预后结局评估有一定参考价值。

综上所述，血清中PKC-α、NF-κB蛋白高表达，且均与ACT患者NIHSS、mRS评分呈正相关，是影响ACT患者不良预后的危险因素。但由于本研究样本量少，存在不足，另关于PKC-α、NF-κB信号通路在ACT发生发展中的具体作用机制尚不清楚，后期需要加大样本量进一步深入研究。