一株腐败希瓦菌的药敏试验及其与沙门氏菌的差异性比较

高顺华，王兴敏，刘 菲，康欣悦，王保霖，周贺霞

（1.成都医学院检验医学院，四川成都610500；2.四川省动物源性食品兽药残留防控技术工程实验室，四川成都610500）

希瓦菌（Shewanellaspp.）被认为是引起水产高蛋白食品腐败变质的主要细菌类群。也有研究指出，希瓦菌是人和水生动物的机会致病菌，但由于其多数为嗜冷菌而不为临床微生物学家所关注[1]。其生长发育受温度影响较大，生长的温度范围为1～40℃[2-3]。现作为生物催化剂被应用于发酵、发电、采矿等多个领域[4-6]。由于抗生素的普遍使用，由希瓦菌引起的感染日益增加。近年来，国内外有大量关于腐败希瓦菌感染海水养殖动物、淡水养殖动物甚至部分临床患者感染案例的报道。汪永禄等[7]国内首次从2起聚餐性食物中毒腹泻患者标本中分离到海藻希瓦菌和腐败希瓦菌，并提出其可能为食物中毒的病原菌。魏超等[8]首次从鲜猪肉中检出腐败希瓦菌，并发现其对复方新诺明、土霉素、卡那霉素完全耐药。秦蕾等[9]报道了异育银鲫暴发的腐败希瓦菌感染，发现感染发病的鱼躯干充血发红，肛门红肿，解剖发现有腹水，花斑肝，高浓度组发病鱼腹腔可见点状出血。郭全友等[10]经研究确定，冷藏大黄鱼的优势腐败菌为腐败希瓦。张莹等[11]研究发现，腐皮综合症病灶中部分优势菌存在N-酰基高丝氨酸内酯类化合物介导的群体感应系统，其中，腐败希瓦菌活性最高。KOZIÑSKA等[12]从鲤鱼、鳟鱼体内分离得到2株腐败希瓦菌，对鱼进行腹腔注射后产生疾病征兆；KORUN等[13]从鲈鱼体内分离得到腐败希瓦菌，该菌株可引起皮肤溃疡、肾功能受损、脾脏肿大。方四倍[14]报道了希瓦菌引起的2例血流感染；丁秀荣等[15]报道了希瓦氏菌感染7例肝病患者，其中，血流感染2例，腹膜炎4例，胆道感染1例。朱聪智[16]也从老年肺炎患者痰液中检出腐败希瓦菌。ROUZIC等[17]也曾报道过腐败希瓦菌感染肝硬化和糖尿病患者的案例。这些研究都证明了腐败希瓦菌的潜在危险性。故该菌应引起微生物学和临床学界的高度关注。沙门氏菌为革兰氏阴性杆菌，需氧及兼性厌氧，无芽孢无荚膜，大多周生鞭毛，为常见致病菌，感染沙门氏菌的人或食用带菌者粪便污染的食品均会引起食物中毒。而腐败希瓦菌与沙门氏菌同为革兰氏阴性杆菌，周生鞭毛，能运动，二者在沙门氏菌显色培养基、BS培养基上的菌落特征较相似，并且均可在血平板上发生溶血。腐败希瓦菌虽为条件致病菌，但其近年来引起多起临床感染，在养殖动物及病人分泌物中多次被分离出。

本试验从鱿鱼中分离检测出腐败希瓦菌一株，经ATB生化鉴定和基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱（Laser Desorption lionization Time of Flight Mass Spectrometry）鉴定后接种血平板和BS培养基，并用5类9种常见抗生素对其进行抗性比较，以期为腐败希瓦菌防控提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

供试冻藏鱿鱼购于市场。

1.2 仪器设备与试剂

ATB微生物鉴定仪、ATB试剂条ID 32E、NaCl 0.85%Medium（法国生物梅里埃公司）；MALDITOF-MS（日本岛津，AMIMA Confidence）；生物安全柜（上海立申仪器设备有限公司，HF-safe-1200）；生化培养箱（上海齐欣科学仪器有限公司，LRH-500F）。

缓冲蛋白胨水（BPW）（广东环凯微生物科技有限公司）；营养琼脂培养基、血平板（北京陆桥技术有限责任公司）；法国科玛嘉沙门氏菌显色培养基（上海欣中生物工程有限公司）；抗生素药敏片：青霉素G、土霉素、氯霉素、链霉素、罗红霉素、庆大霉素、卡那霉素、环丙沙星、复方新诺明（Oxoid公司，Φ6 mm）、甲酸（TEDIA，色谱纯）、乙腈（Thermo Fisher Scientific，色谱纯）、α-氰-4-羟基肉桂酸（α-CCA）（SIGMA，suitable for MALDI-TOF-MS）。

1.3 试验方法

1.3.1 腐败希瓦菌的分离纯化和生化试验 于无菌间准确称取25.0g样品置于装有225mLBPW的无菌均质袋中，用拍击式均质器以8 000～10 000 r/min均质2 min。将均质后样品放于36℃恒温培养箱中前增菌培养18 h，混匀后移取1 mL转种于10 mL TTB内，于（42±1）℃培养24 h。同时，另取1 mL转种于10 mL SC内，于（36±1）℃培养24 h。于生物安全柜中划线接种于沙门氏菌显色平板和BS琼脂。挑取可疑单菌落接种三糖铁琼脂，先于斜面划线再于底层穿刺，并接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于（36±1）℃培养18～24 h。

1.3.2 腐败希瓦菌的鉴定

1.3.2.1 生化鉴定 挑取血平板上的单菌落于比浊管，混匀并调整至0.5麦氏浓度（约1.5×108cfu/mL），用移液枪将样品加至试剂条样杯中，其中，鸟氨酸脱羧酶（ODC）、精氨酸双水解酶（ADH）、赖氨酸脱羧酶（LDC）、尿素酶（URE）、L- 阿拉伯醇（LARL）、d-半乳糖酸盐同化（GAT）、5-酮葡萄糖酸（5KG）7个项目用石蜡油液封，保证其孔为厌氧状态，由ATB微生物鉴定系统检测分析数据并得到最终结果。

1.3.2.2 质谱鉴定 挑取血平板上单个菌落于1 mL乙醇中，振荡 1 min，40 kHz超声 10 min，8 000 r/min离心2 min，弃上清后加入70%甲酸水溶液50～100 μL，振荡混匀超声10 min，再加入100%乙腈50～100 μL，振荡混匀静置 30 min，超声 10 min，8000r/min离心2min，取上清液1μL点至靶板，自然晾干后加入1 μLα-CCA，静置晾干后上机检测。

1.3.2.3 检测条件 ESI离子源，氮气激光器，固定聚焦337 nm，激光能频72～88 Hz，初始能频80 Hz，收集范围3 000～13 000，采用ATCC 8739标准大肠杆菌校准，将微生物图谱质荷比（m/z）信息导入MALDI-TOF/SARAMIS数据库系统与其中的超级谱图进行匹配，从而得出微生物质谱鉴定结果。

1.3.3 腐败希瓦菌药敏试验 取1.3.2.1中菌悬液55 μL于空白平皿中，将配制好的营养琼脂冷却至45～50℃后倾注平皿，振荡混匀，待培养基凝固后，将药敏片用无菌镊子贴于培养基表面，每种药敏片做一个平行，每皿2片，以空白为对照，于36℃恒温培养24 h，观察抑菌圈形态并测量其直径。按照药敏试验抗性标准抑菌圈直径判定敏感度：抑菌圈直径在20 mm以上为极敏，在5～20 mm为高敏，在10～14 mm为中敏，在10 mm以下为低敏，0 mm为不敏[18]。

2 结果与分析

2.1 菌落特征

表1 培养基上的菌落特征

该菌在沙门氏菌科玛嘉显色培养基呈光滑淡紫色菌落、BS琼脂上呈灰绿色菌落，在血平板上发生溶血，在TSI琼脂上斜面呈红色、底层呈黄色、底部形成黑色沉淀，穿刺接种呈扩散性生长（表1）。

2.2 生化鉴定和质谱鉴定

生化鉴定结果如表2所示。经系统鉴定，该微生物为腐败希瓦菌（Shewanellaputrefaciens SP.），其中，T值为1.0，ID值为98.4%。其中，T值表示其生化反应结果与该菌最典型生化谱的接近程度，ID值为根据被鉴定菌株的生化反应模式得出的鉴定结果，其可信度在已知的菌库细菌中所占的百分比。当ID＞90.9%、T＞0.25时鉴定结果较好。因此，腐败希瓦菌的鉴定为好的鉴定结果。

表2 腐败希瓦菌生化鉴定结果

质谱鉴定结果 MALDI-TOF-MS图谱如图1所示。经与SARAMIS数据库中匹配，鉴定该菌为腐败希瓦菌。

2.3 药敏试验结果

本试验采用常见的9种人用或兽用抗生素进行抗性试验，β内酰胺类抗生素采用青霉素G；氨基糖苷类抗生素采用庆大霉素、卡那霉素、链霉素；四环素类采用土霉素；大环内酯类抗生素采用罗红霉素；氯霉素类抗生素类采用氯霉素；磺胺类抗生素采用复方新诺明；喹诺酮类抗生素采用环丙沙星。并且该菌倾注平皿后呈表面生长，表明其为严格需氧型。抑菌情况列于表3，氯霉素及青霉素敏感试验如图2、3所示。从表3可以看出，卡那霉素、庆大霉素、罗红霉素、土霉素、氯霉素、链霉素、复方新诺明、环丙沙星都表现出对此菌的明显抑制作用（氯霉素抑制效果最强，复方新诺明效果有限），仅青霉素G对其无抑制作用。

表3 腐败希瓦菌药敏试验结果

2.4 腐败希瓦菌和沙门氏菌的差异性比较

试验用《食品安全国家标准 食品微生物学检验沙门氏菌检验》（GB 4789.4—2016）方法对鱿鱼样品进行检测，选择分离所得菌落在BS琼脂与沙门氏菌显色培养基上均表现为沙门氏菌可疑菌落，并且该菌在血平板上发生溶血。分离菌株经ATB生化鉴定和质谱鉴定确定为腐败希瓦菌。接种TSI琼脂和赖氨酸脱羧酶培养基后三糖铁琼脂斜面产碱底层产酸，H2S阳性，赖氨酸脱羧酶试验呈阴性。根据GB4789.4—2016方法可初步判断为可疑沙门氏菌属；再与沙门氏菌属生化反应初步鉴定表反应序号A1对应，只有赖氨酸脱羧酶一项反应结果不一致，与甲型副伤寒沙门氏菌十分相似。这可能会对沙门氏菌的鉴定带来较大干扰。但将腐败希瓦菌药敏试验结果（表3）与沙门氏菌生化表进行比较发现，沙门氏菌通常能发酵葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、山梨醇，不发酵乳糖、蔗糖和侧金盏花醇，不产吲哚，不水解尿素。而由腐败希瓦菌生化鉴定结果可以看出（表2），腐败希瓦菌不能发酵葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇、山梨醇和侧金盏花醇；不产吲哚，不水解尿素，但能利用丙二酸盐，产L-天冬氨酸芳胺酶。由此可以看出，二者生化反应差别较大。

3 结论与讨论

3.1 腐败希瓦菌与沙门氏菌的差异性分析

试验从鱿鱼中分离纯化得到一株腐败希瓦菌，该菌在BS琼脂与沙门氏菌显色培养基上均表现为沙门氏菌可疑菌落，并且该菌在血平板上发生溶血。这与沙门氏菌在BS琼脂、沙门氏菌显色培养基、血平板等培养基上的菌落特征十分相似。而进一步生化试验比较发现，二者在生化反应中存在较大区别。故可以通过生化反应的差异性将二者进行区分。关于两菌在BS琼脂、沙门氏菌显色培养基、血平板上菌落特征相似的机制还有待进一步试验研究。

3.2 菌株耐药性及潜在危险性分析

药敏试验结果显示，该菌株对8种常用抗生素极为敏感，其中，复方新诺明抑制效果不佳，菌苔抑菌圈内完全浑浊，并且青霉素G对其毫无抑制效果。近年来相关研究表明，腐败希瓦菌分别对磷霉素、氨苄西林、复方新诺明、土霉素、卡那霉素等多种常见抗生素表现出完全抗性。感染动物主要表现为体表溃烂、肝肿大、皮肤黏膜出血性病变。其耐药性菌株间存在较大差异，其原因可能与抗生素的滥用及地区环境差异密不可分。这种抗性抗致使受到感染后治疗恢复极其困难，对其进行耐药性总结对临床用药具有较大参考意义。