一株降解煤油菌株的筛选与鉴定

周骏驰， 宋枭枭， 徐 盼， 曹张军

东华大学化学化工与生物工程学院，上海 201620

石油及其产品在开采、炼制、贮运和使用过程中进入海洋环境会造成严重污染；其中溢油污染危害最大，石油泄漏被称为海洋污染的超级杀手。全世界每年因油轮事故溢入海洋的石油约为39万吨[1]，到2016年已有超过140次大的油泄漏事件将700万吨油泄漏造成环境污染[2]。石油烃已成为世界海洋(尤其是浅海)的主要污染物。石油污染物与常规污染物有所不同，一旦污染水域或食物链，进入人体后不易遭到破坏，并且仍保持它的持久性、累积性、迁移性和高毒性时，必然危及机体，表现出致癌性、致变性和致畸性，严重威胁人类健康。对溢油污染进行治理，改善、恢复污染区域的生态环境，保护海洋环境和海洋资源，促进可持续发展是世界各国义不容辞的责任[3]。

目前处理溢油的方法有物理法(吸附、机械拦截)、化学法和生物法[4，5]。化学法由于使用化学试剂毒性大，造成生态环境危害，难以大范围广泛利用。围栏法、撇油器法、吸油材料法、活性炭吸附过滤法的物理法主要是应对大规模、大范围的海面石油泄漏事故，将原油吸收、捕捉后再分离、回收。但对于密度小、黏度小，在海面扩散速度快的汽煤柴等轻质油及大规模处理后残余量油，目前工艺方法难以奏效。以油作为生长底物的微生物处理作为主要的生物处理法，可以作为转化油污污染的生物源，而细菌修复具有安全、经济性强、应用范围广、去除效率高和无明显的二次污染等显著优点[6]。因此分离筛选到适应力强，降解轻油能力高的微生物是生物处理法的关键。

本论文鉴定了一株从从活性污泥中分离到降解轻油微生物，并确定了其生长适合条件及降解能力。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1样品

本实验所用活性污泥由上海市松江污水处理厂提供，油污染土壤取自工厂油污染区。

1.1.2培养基

富集培养基(g/L)：NaCl 5.0，蛋白胨5.0，葡萄糖10.0，pH 7.0，121℃，灭菌20 min。

固体牛肉膏蛋白胨培养基(g/L)：NaCl 5.0，蛋白胨10.0、牛肉膏5.0、琼脂18.0，pH 7.0，121 ℃，灭菌20 min。

LB种子液体培养基(g/L)：NaCl 10.0，酵母粉5.0，蛋白胨10.0，pH 7.0，121 ℃，灭菌20 min。

煤油液体培养基(g/L)：NH4Cl 5.0、KH2PO45.0，KCl 0.1，MgSO45.0，CaCl20.02，FeSO40.1，NaCl 15.0，K2HPO41.0，轻油30.0，pH 7.2～7.4，115 ℃，灭菌30 min。

1.2 菌种的富集与筛选

1.2.1菌种的富集驯化[7]

配制含有浓度梯度的油污染土壤的筛选培养基，分别将1 g、2 g和3 g油污染土壤加入装有100 mL筛选培养基的250 mL的锥形瓶中，121 ℃，灭菌20 min。加入取自上海市松江污水处理厂的活性污泥10 mL。驯化条件为28 ℃，160 r/min恒温震荡培养箱中培养7 d。进行梯度富集培养。

1.2.2菌种的筛选[8，9]

将富集驯化完的培养液经梯度稀释为10-2～10-6，用涂布棒涂布于固体牛肉膏蛋白胨平板上。放入恒温培养箱中在28 ℃培养3 d，挑取颜色及形态良好的单菌落，在新鲜的固体牛肉膏蛋白胨上反复划线分离，直至菌落形态一致，镜检无杂菌，将其置于4 ℃冰箱中留存待用。

1.3 细菌鉴定

1.3.1菌株的形态学观察[10]

将菌株在LB培养基平板划线于35 ℃培养，肉眼观察菌落形态。并进行革兰氏染色检验。

1.3.216S rRNA基因序列的基因序列扩增、比对和系统发育分析[11]

PCR扩增体系为50 μL:上游引物(27F: AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)2 μL，下游引物(1522R:AAGGAGGTGATCCAGCCGCA)2 μL，PCR Buffer 5 μL，Mg2+3 μL，DNA模板5 μL(细菌沸水5 min，稀释20倍)，dNTP 1 μL，Taq酶 0.5 μL，ddH20 31.5 μL。扩增程序为:95 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，30个循环，72 ℃延伸10 min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测无误后，送于生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

所得序列通过BLAST亲缘关系分析，并用MEGA构建分子进化树。

1.4 细菌生长培养条件研究

1.4.1初始pH对菌株生长的影响

配制100mL pH为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0(±0.02)的LB培养基于250 mL锥形瓶中，按1%接种量接种活化12 h的菌液，35 ℃、160 r/min下振荡培养，定期取适量菌液测定其OD600。

1.4.2温度对菌株生长的影响

配制100 mL pH为7.0的LB培养基于250 mL锥形瓶中，按1%接种量接种活化12 h的菌液，分别在23 ℃、26 ℃、29 ℃、32 ℃、35 ℃和38 ℃，160r/min振荡培养，定期取适量菌液测定其OD600。

1.5 细菌降油能力测试[12]

挑取生长形态良好的单菌落，接入5 mL LB液体种子培养基中，35 ℃，160 r/min，置于恒温摇床中培养12 h。接种1 mL种子液于100 mL煤油培养基中，35℃，160 r/min，置于恒温培养箱中分别培养5 d和7 d。培养完成后，利用30 mL二氯甲烷进行萃取，计算菌种降油能力。按照下列公式计算菌对煤油降解率:

降解率(%)=(原始煤油质量-培养后剩余煤油质量)/原始煤油质量×100%。

2 结果与讨论

2.1 菌株筛选结果及形态学鉴定

将驯化的菌液稀释涂布进行初筛获得长势良好的单菌落。再经回接、纯化和形态观察进行复筛，得到生长状态优良的单菌落。挑选其中生长速度最快且长势最佳的菌株作为试验菌，命名为5092-2。5092-2菌种菌落呈白色，圆形，突起，湿润，有光泽，全缘；菌体革兰氏染色呈阴性，杆状，长度5.0 μm～10.0 μm。

2.2 菌种的分子学鉴定

PCR扩增5092-2菌株16S rRNA基因，得到预期1.5 kb左右大小条带。扩增样品经生工生物工程(上海)股份有限公司测序，将所得序列在NCBI数据库中进行blast比对，结果显示5092-2菌株为Mangroveibactersp.。利用MEGA6.0构建分子系统发育树如图1所示。

2.3 5092-2菌株生长条件测定

菌株5092-2在起始pH为5.0至9.0生长情况如图2所示。从图中可以看出，菌株5092-2在pH 5.0～9.0区间内，生长无明显差异，具有较强pH适应性。

菌株5092-2在培养温度23 ℃到38 ℃生长情况如图3所示。从图中可以看出，温度对菌株5092-2生长影响不大，特别在26 ℃至35 ℃温度区间内，生长无明显差异。

2.4 细菌降油能力测试

将煤油和菌混和培养，培养规定时间后，萃取培养基中残存煤油，计算煤油残存率。结果显示，5092-2降解时间为5 d时，煤油剩余质量为2.05 g，菌种煤油降解率为31.7%，降解时间为7 d时，煤油剩余质量为1.43 g，菌种煤油降解率为52.3%。

图1 菌株5092-2 16S rDNA系统发育树

图2 起始pH对5092-2生长影响

图3 温度对5092-2生长影响

3 结论

经过初筛与复筛得到一株长势最佳的菌株(命名为5092-2)进行形态观察及分子鉴定，判定菌株5092-2为Mangroveibactersp.。在温度为35 ℃，pH为7.2～7.4，恒温摇床转速为160 r/min，7 d降解煤油能力到达52.3%，李平等[12]以石化厂附近长期被石油污染的土壤微生物为菌源，煤油作为唯一碳源，在最佳培养条件下，煤油降解率达到42.6%。KHAN等[13]从受石油烃污染的土壤中分离出SDX7，3%煤油浓度，在最佳培养条件下，16 d培养后降解58%。AYDIN等[14]分理出taphylococcusaureusBa01，DelftiaacidovoransCd11等菌株，以1%煤油作为唯一碳源，在最佳培养条件下，21 d培养后降解70%～84%。本论文菌株降解煤油能力明显，为进一步研究奠定了基础。