黄芪丹参配伍提取物经VEGF、Ang1/Tie2通路对心肌梗死大鼠血管新生的病理影响

张瓅方， 李梦华， 刘 暖， 杨 雷， 毛秉豫*

(1.南阳理工学院河南省张仲景方药与免疫调节重点实验室,南阳 473004；2.南阳医学高等专科学校,南阳 473061)

心肌梗死(myocardial infarction,MI)以心肌缺血、缺氧为主要特征,其发病率和致死率均较高。据世界卫生组织统计,缺血性心脏病占到死亡总数的13%,其中MI死亡率又居首位[1]。在中国因MI致死的心脏病已排在成人死亡率的第1位,因此深入研究MI防治具有积极的现实意义。目前临床治疗MI采用的方法有口服药物控制、外科手术以及近些年出现的介入治疗,但不论是药物还是外科干预都存有副作用或并发症等弊端。治疗性血管新生在心肌血管的再生作用被研究者称为“分子搭桥”,鉴于MI发病机制以循环障碍为主,因此有效建立侧支循环通路改善心肌供血已成为防治MI的热门方向[2—4]。

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是目前公认最强大的促血管生成因子,由VEGF介导的信号级联反应在血管生成过程中发挥着重要作用。血管生成素(Ang)是目前已知所有血管生成因子中独具核糖核酸酶活性的因子,贯穿于血管生成全部过程,促血管生成能力非常强。血管稳定因子Ang1是受体酪氨酸激酶Tie2主要激动剂,Ang1/Tie2信号通路具有维持血管完整性和促进血管新生的作用[5]。有研究显示,小鼠体内缺失Ang1或Tie2基因,在胚胎期的血管系统发育就出现异常,小鼠寿命缩短。如Ang1不能有效激活Tie2,则血管内皮细胞和间质细胞无法紧密连接[6]。由此可见Ang1/Tie2信号通路在一定程度上弥补了VEGF的不足,尤其在促进早期小血管发育进程中发挥着比VEGF更加完善的作用。前期经过实验研究证实了以“益气化瘀,通络生脉”的黄芪、丹参配伍提取物在促进MI大鼠心肌组织血管新生的作用与上调VEGF表达相关[7-8]。在此基础上进一步观察MI大鼠心肌组织中VEGF和Ang1/Tie2信号通路的病理变化,为中药黄芪、丹参在促进血管新生治疗MI提供实验数据支持。

1 材料

1.1 动物

8周龄清洁级雄性SD大鼠,体重200～230 g,购自河南省实验动物中心(动物生产许可证:SCXK(豫)2015-0005；动物质量合格证:1001297)。标准化饲养方式,动物实验操作已通过南阳理工学院动物伦理委员会批准(批准号:2018DW-021)。

1.2 药物、试剂、仪器

黄芪、丹参提取物在国家自然科学基金项目“黄芪丹参配伍提取物对心肌梗死后心室重构中PKD-AP-1/C-Jun-MMPs信号传导通路影响的研究(71173372)”基础上,由南阳理工学院方药研究所经水提、大孔吸附树脂纯化所得(黄芪总苷含量66.9%,丹参总酚酸含量63.7%)。VEGF单克隆抗体(上海沪鼎生物科技有限公司,批号:F324458)、Ang1抗体(上海誉博生物科技有限公司,批号:K72452)、Tie2抗体(上海蓝木化工有限公司,批号:S157701)、羊抗兔IgG(武汉博士德生物工程有限公司,批号:TC1378)、DAB显色液(武汉博士德生物工程有限公司,批号:DD1660)、其他试剂为国产分析纯。HX-100E型动物呼吸机(泰盟科技有限公司)、Tis型光学显微镜及NIS-Elements Software BR分析系统(日本尼康公司)。

2 方法

2.1 MI模型建立

参照MI大鼠模型复制过程[8],SD大鼠以10%水合氯醛3 mL·kg-1行腹部注射麻醉后,仰卧位固定手术台上接入呼吸机和心电监护,观察心肌梗死后心率和心电图变化。在大鼠左侧第4肋间纵切5 mm,钝性分离肌层置开胸器,剪开心包层暴露心脏。在大鼠心脏冠状动脉根部约3 mm处用眼科5-0型缝合线穿线结扎。肉眼可见附近心肌颜色变暗,心电图II导连ST段弓背太高、QRS波增宽显示模型复制成功。逐层缝合胸腔待大鼠恢复自主呼吸后撤去呼吸机和心电监护,术后行腹腔注射青霉素80万U 3 d预防感染。正常、MI大鼠心电图见图1、图2。

心率:385次/min；电压最大值:0.25 mV；电压最小值:-0.35 mV；电压峰峰值0.6 mV图1 正常大鼠心电图Fig.1 Electrocardiogram of normal rats

心率:378次/min；电压最大值:0.32 mV；电压最小值:-0.1 mV；电压峰峰值:0.43 mV图2 MI大鼠心电图Fig.2 Electrocardiogram of MI rats

2.2 分组、用药

实验分为:假手术对照组(A组,开胸穿线后不接扎)、模型组(B组,给予等量生理盐水)、黄芪、丹参配伍提取物低、中、高剂量组(C组、D组、E组分别给予10、20、40 mg·kg-1·d-1。持续用药4周。

2.3 大鼠一般情况

实验过程中观察各组大鼠的精神状态、体重变化、身体情况、死亡情况等。

2.4 HE染色

采集大鼠心尖部组织后以10%甲醛固定24 h。装入包埋盒中脱水并依次石蜡包埋。包埋好的组织块以4 μm厚度切片,45 ℃烤片后标记备用,分别用于HE染色和免疫组化检测。

HE染色步骤:先将石蜡片60 ℃加热30 min,浸泡二甲苯内脱蜡5 min反复3次,依酒精浓度梯度递减100%、95%、85%、75%依次脱水。用苏木素染色5 min后水洗,盐酸酒精分化30 s后水洗,氨水返蓝30 s后水洗,转伊红染色10 min水洗。再次将切片依酒精浓度梯度递增75%、85%、95%、100%依次脱水后晾干,采用中性树胶封片。400倍光学显微镜拍照。

2.5 免疫组织化学染色

心肌取材部分同HE染色步骤烤片和脱蜡。抗原热修复把切片放入枸橼酸缓冲液(pH=6.0)95 ℃计时5 min后取出冷却至室温。磷酸盐缓冲液(PBS，pH=7.2)反复清洗3次,每次5 min。滴加3%过氧化氢室温抚育30 min后,PBS缓冲液再次重复清洗3次(5 min/次),甩干后加入5% 牛血清白蛋白(BSA)封闭30 min。去除BSA溶液后,加入一抗(1∶100稀释的VEGF、Ang1、Tie2)覆盖组织,置于4 ℃冷藏12 h。取出保温盒复至常温后清洗3次(5 min/次),加入二抗羊抗兔IgG(1∶200稀释)37 ℃孵育60 min,二氨基联苯胺(DAB)溶液显色。苏木素复染后蒸馏水洗涤,二甲苯脱水透明,采用中性树胶封片。400倍光学显微镜下,取6个不重叠视野拍照分析,NIS-Elements Software BR分析系统计算VEGF、Ang1和Tie2蛋白的平均吸光度,对目标蛋白表达进行半定量分析。

2.6 统计方法

采用SPSS软件统计分析,计量数据以均数±标准差(x±s)表示,组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 一般情况

在4周的实验过程中,A组大鼠饮食和体重均有所增加、二便正常、精神状态稳定、反应灵敏、皮毛有光泽度；B组大鼠饮食减少、体重下降、活动减少、反应迟缓；C组、D组和E组大鼠整体情况与B组比较有不同程度改善。40只大鼠除B组死亡1只外,其余各组均存活,大鼠资料收集完整。

3.2 HE染色结果

HE染色结果如图3所示。A组心肌细胞完整、色泽鲜红,各组织排列有序,细胞边缘规则,周围血管腔完整,显微镜视野下整体形态分布较完整。B组心肌组织排列紊乱,出现大片坏死并伴有周围炎性反应,细胞边缘伴有中性粒细胞浸润,成纤维组织机化,整体形态模糊不清。C组、D组和E组心肌细胞色泽逐渐鲜亮转红,组织间隙规则,其中C组还伴有部分炎性反应和增生的成纤维组织,D组和E组的心肌细胞排列结构清晰,周围血管腔完整。提示黄芪、丹参配伍提取物有维持细胞完整、促进血管新生的作用。

图3 MI大鼠各组心肌组织HE染色结果(×400)Fig.3 Results of HE staining of myocardial tissue in each group of MI rats(×400)

3.3 MI大鼠各组心肌组织中VEGF、Ang1、Tie2蛋白表达影响

MI大鼠各组心肌组织切片经免疫组织化学染色后,VEGF、Ang1、Tie2阳性细胞在心肌细胞胞浆内可见深浅不一的棕褐色颗粒。经NIS-Elements Software BR分析系统显示:与A组相比,B组胞浆中VEGF、Ang1和Tie2阳性细胞表达升高,两组相比具有统计学差异(P<0.05)。与B组相比,C组、D组和E组胞浆中VEGF、Ang1和Tie2阳性细胞表达随药物浓度增高逐渐上升(P<0.05或P<0.01)。提示黄芪、丹参配伍提取物可提高VEGF、Ang1和Tie2蛋白的表达水平。见表1、图4。

图4 MI大鼠各组心肌组织中VEGF、Ang1、Tie2蛋白表达结果(×200)Fig.4 Results of VEGF, Ang1, Tie2 proteinexpression in myocardialtissue of MI rats (×200)

4 讨论

“痹”,乃闭塞不通之义,早在《黄帝内经·素问·痹论》篇中就记载“心痹者,脉不通……痹在与脉,则血凝而不流[9]。”中国医学中以胸部闷痛或胸痛彻背为主症的症候群归为胸痹范畴诊治,现代医学中以心肌缺血、缺氧为主要特征的心肌梗死亦可纳入治疗。引起胸痹的原因有寒凝、气滞、血瘀、痰浊、阳虚、气虚等多种,总结病机不外乎虚、实两种；治疗方法有通阳散寒、行气散结、活血化瘀等多样,始终围绕“不通则痛、通则不痛”的“通”法。中药黄芪性温味甘,有补气升阳、托毒生肌等功效,早在《神农本草经》就记载此药:“可治一切气衰血虚之证”,是临床常用补气药。“一味丹参饮,功同四物汤”中的丹参性微寒味苦,有活血化瘀,行气止痛等功效,是临床常用活血化瘀药。黄芪、丹参合用体现中医在胸痹病中“气行血生”的治疗特色,项目组前期观察黄芪、丹参配伍治疗能有效缓解心绞痛、心肌梗死等气滞血瘀型患者疼痛感,改善心肌供血,临床疗效较好[10-11]。心肌梗死后的修复及预后与心肌细胞、血管功能密切相关,因此有效建立侧支循环通路对改善心肌梗死区有着至关重要的意义。这种诱导心肌自我搭桥的“治疗性血管新生”方法已成为现代治疗心脑血管疾病的攻克方向,促进血液循环,增加血管新生的现代医学理论恰巧与中医学中“气为血之帅、血为气之母”气行则血生的气血并治理论相同,因此项目组继续以从益气化瘀、通络生脉的黄芪、丹参配伍提取物为组合药对,探讨其促血管新生的作用机制。

表1 MI大鼠各组心肌组织中VEGF、Ang1、Tie2蛋白表达比较

注：与假手术对照组相比,*P<0.05；与模型组相比,#P<0.05、##P<0.01。

血管新生是一个复杂的系列过程,在发生过程中需要募集各种细胞因子参与。VEGF在血管新生过程中可以促进内皮细胞增值、分化,对抗炎性细胞等各种损伤因子[12]。Ang1/Tie2信号通路是近些年发现除VEGF/VEGFR信号通路之外新的血管生成通路,在血管生成的生理和病理过程中均发挥重要作用[13,14]。Ang1可维持新生血管内皮细胞稳定,限制异常血管的新生；Ang2对Ang1有拮抗作用,对内皮细胞中丝分裂信号敏感性强,促使异常血管形成。Ang1和Ang2共同作用与受体Tie2发挥调节内皮细胞稳定性的作用。血管新生的早期阶段因细胞外基质发生降解伴随着血管通透性增加,刺激一系列血管生成因子从而激发内皮细胞数量增殖迁移,是生出肉芽组织方式逐渐形成新生血管[15]。实验结果显示,模型组在HE染色和免疫组织化学染色中均呈现出心肌纤维化结构、组织排列紊乱,内皮细胞损伤严重并伴有胞核溶解现象。

在这些受损的不利因素刺激下,模型组VEGF、Ang1和Tie2蛋白因子虽有所增加,但却未形成成熟的新生血管,并容易出现瘢痕组织,可见这是机体自我防御保护中采取的一种应急性措施。经过黄芪、丹参配伍提取物干预后,各组随着药物浓度的提高,原有受损的心肌组织逐渐被出现的新生血管代替,炎性侵润减少,肉芽组织良性生成较多,心肌细胞色泽鲜红且排列有序。VEGF、Ang1和Tie2蛋白因子呈药物浓度依赖性增加,HE染色光学显微镜下心肌组织的病理形态学变化和免疫组织化学结果高度一致。

5 结论

实验证实心肌细胞在缺血、缺氧条件下,经黄芪、丹参配伍提取物干预后作用明显,VEGF保护性表达增加,有效地减少了内皮细胞损伤,增加血管壁通透性,促进参与血管生成因子的增殖和分化。Ang1/Tie2信号通路加速内皮细胞分化、增殖和迁移,出芽生成新的血管腔结构并维持血管腔结构稳定。VEGF和Ang1/Tie2信号通路在血管新生过程中相互协同,有效改善心肌再灌注状态。