γ-氨基丁酸A受体相关蛋白研究进展

许海方 谢陈南 应晨怡 陈锡冰 杨受保

(绍兴文理学院 生命科学学院，浙江 绍兴 312000)

γ-氨基丁酸A受体相关蛋白(Gamma-aminobutyric acid receptor-associated protein，GABARAP)在多种组织中广泛分布，能与多种胞内因子发生互作，高度调控自噬体的运输[1-3]、自噬体的形成与成熟[4-6]、自噬通量的控制以及对雷帕霉素诱导细胞自噬[7-8]等过程，从而广泛参与细胞和机体的多种重要的生理病理过程，如细胞凋亡[9-10]、免疫应答[11-12]和抗肿瘤[13-14]等.本文从分子生物学特性、互作蛋白及生物学功能等方面概述了GABARAP的研究进展.

1 GABARAP的分子生物学特性

1.1 GABARAP的家族

GABAA受体相关蛋白，属于GABARAPLl、GABARAPL2、GABARAPL3、GABARAPL4、LC3(Microtubule associated protein 1 light chain 3)、酵母Apg8或Aut7p和线虫LGGs蛋白构成的古老蛋白家族中的一员，这个家族蛋白的氨基酸序列从单细胞的酵母到多细胞的哺乳动物均高度保守，与泛素的三级结构高度相似，且所有的蛋白均可以进行细胞内运输.目前对该家族的研究主要集中于酵母、人类和其他模式生物中.1999年Wang等[15]首次利用酵母杂交技术从人脑cDNA文库中筛选并克隆了GABARAP基因.Kneussel等[16]对GABARAP基因进行克隆和表达分析，总结了GABARAP的进化地位.

1.2 GABARAP的结构

人源GABARAP蛋白由117个氨基酸组成，分子量约为14 kDa，在进化上高度保守.氨基酸序列比对显示，GABARAP和微管相关蛋白(Microtubule associated protein，MAP)具有较高的同源性，并且都能与多种其他蛋白相结合[17].GABARAP由N-端亚结构域(1-26aa)和C-端结构域(27-117aa)组成，其中N-端亚结构域含有α1和α2螺旋，可以和微管蛋白结合；C-端和泛素的结构很相似，含有4链的β折叠和α1、α2两个螺旋，可与GABAA受体结合[15].

1.3 GABARAP的分布与表达

GABARAP在心、脑、睾丸、卵巢和胰腺等多种组织、器官中广泛分布，但其分布存在时间和空间上的差异.Wang等[15]用免疫学方法证明，GABARAP在神经元的胞体和突触中均有分布，且在心、脑、肝脏和胰腺等组织中均有不同程度的表达.白荣耀[18]发现GABARAP在杂色鲍的各种组织中广泛表达，在大部分组织中的表达均为中等强度，但在肝胰脏组织中表达量最高，在血细胞中表达量最低；在杂色鲍的胚胎和幼体的发育过程中也有表达，且存在时间和空间上的差异；且从受精卵到十六细胞期，GABARAP的表达比较稳定，桑椹胚时期GABARAP的表达水平急剧上升，直到原肠胚时期GABARAP的表达水平达到了高峰，之后GABARAP的表达水平急剧下降至接近受精卵时期水平.李金玲等[19]发现从斑马鱼2个细胞的受精卵一直到受精后24小时的胚胎中，GABARAP都呈高表达状态，且这个基因极有可能是母体的遗留物.

上述研究表明GABARAP在多种组织中广泛分布，特别是在胚胎发育时期，GABARAP这种时间和空间上的差异表明其可能参与胚胎和幼体的发育过程，在生物体的生命过程中发挥着广泛而重要的作用.

2 GABARAP的互作蛋白

2.1 ATG13

自噬相关蛋白13(Autophagy-related protein 13，ATG13)，和ULK1(Unc-51 like autophagy activating kinase 1)、ULK2(Unc-51 like autophagy activating kinase 2)、FIP200及ATG101(Autophagy-related protein 101)等均为ULK自噬复合物的重要成员[20-21].Alemu等[22]用pulldown分析证明GABARAP蛋白可与ULK复合物发生互作，并且作为自噬开始阶段的支架组装在ULK复合体上，其中，ATG13与GABARAP亚家族有强相互作用.ATG13核心基序C-末端结构域的点突变会强烈地减少其与GABARAP的互作.特别是与核心基序相邻的酸性残基的存在对于其与GABARAP的有效互作至关重要.上述结果表明，GABARAP和ATG13之间的互作是直接的，而不是由ULK复合体的其他成员介导的，并且GABARAP和ATG13的互作在自噬结构的延伸和运输的过程中发挥着关键作用.

2.2 微管蛋白

GABARAP不仅在体内能和微管共定位，在体外也能和微管蛋白(Tubulin)相互结合.Wang等[15]发现GABARAP和微管相关蛋白1A和1B之间的序列高度相似，并且其蛋白N-端的35个氨基酸残基含有微管蛋白的结合位点.Pulldown实验证明，GABARAP可同时与GABAA受体及tubulin结合，促进GABAA受体在细胞膜上的聚集和定位.Coyle等[23]进一步将其与Tubulin的结合位点缩小到了GABARAP的第10～22个残基上，并发现GABARAP的其它区域可以增加其与微管蛋白的聚合活性，特别是H2螺旋结构域.由此，我们推测GABARAP可通过与微管蛋白结合，来协助受体进行生命活动.

2.3 NSF

N-乙基马来酰亚胺敏感的融合蛋白(N-ethylmaleimide-sensitive fusion protein，NSF)是一种ATP酶，在细胞内膜泡转运过程中发挥着重要作用[24-25].Kittler等[26]直接将GABARAP绑定到NSF上，发现NSF和GABARAP复合物可以在神经元中被检测到，并且这两种蛋白在细胞内膜区室内共定位.同时，他们发现GABARAP可通过与NSF互作，调节胞内囊泡的运输和胞吐过程，以释放出大量的儿茶酚胺等免疫物质.这意味着GABARAP可通过与NSF的互作，参与GABAA受体由细胞质向膜上的运输过程和机体的免疫应答反应.

2.4 DDX47

DEAD-boxhelicase 47(DDX47)是一种RNA解旋酶，参与rRNA加工、前体mRNA剪接、蛋白质翻译、RNA降解以及细胞凋亡等重要的生物过程[27].Lee等[28]用免疫共沉淀筛选到了GABARAP的结合配偶体DDX47，并用酵母双杂交系统进一步证实GABARAP和DDX47可发生相互作用.同时，他们发现将GABARAP和DDX47 cDNA共转染到肿瘤细胞系中可诱导细胞凋亡.上述研究表明，GABARAP可通过与特定蛋白的互作，参与细胞增殖、自噬、凋亡及免疫反应等生物学过程.

2.5 Bcl-2

B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)家族蛋白被认为是细胞凋亡中的基本调节因子，对维持细胞和组织的稳态至关重要[29-30].Ma等[31]用核磁共振证明了Bcl-2对GABARAP具有显著的亲和力，并且两者的互作取决于与BH4区域相邻的Bcl-2的三残基区段(EWD).Pulldown实验证明Bcl-2过度表达会导致GABARAP脂化水平显著降低，从而使得细胞自噬过程中吞噬泡的延长、延伸等环节受到抑制.这些结果支持了GABARAP与Bcl-2复合物在细胞自噬与细胞凋亡中的调节作用，同时建立了细胞凋亡与自噬之间的潜在的复杂联系，并将GABARAP定义为涉及这种复杂联系的新型互作伙伴.

除了以上蛋白以外，GABARAP还与BNI3L(BCL2 interacting protein 3 like)、ATG4B、ULK1、MAPK15、ERK8、GABRG2(Gamma-aminobutyric acid(GABA)A receptor, gamma)、NBR1(NBR1 autophagy cargo receptor)、WDFY3(WD repeat and FYVE domain containing 3)、CALR(Calreticulin)、ATG7、RASF5(Ras association domain family member 5)、TBD2B(TBC1domain family member 2B)及NEDD4(NEDD4 E3 ubiquitin protein ligase)等蛋白相互作用，广泛参与细胞的自吞噬、细胞凋亡、抑制肿瘤和癌症、免疫反应、调节心血管系统、化学突触的传递及蛋白质定位等生物学过程.

3 GABARAP蛋白的功能

3.1 调节细胞自噬

自噬是一种保守的细胞内降解方式，可以实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新，对维持细胞内的环境稳态有着不可或缺的作用.自噬的过程主要分为启动阶段、自噬体的延伸、成熟和降解阶段，涉及超过40个自噬相关蛋白[32].其中，GABARAP蛋白是自噬的良好标记，在自噬体的形成和成熟过程中参与这些蛋白的调控.(1)自噬的起始阶段：GABARAP蛋白可与ATG13、ULK1、ULK2和FIP200互作，并作为自噬开始阶段的支架组装在ULK复合体上.中心体GABARAP在饥饿条件下可运输自噬结构，GABARAP通过特异性激活ULK复合体，调节自噬体形成过程中的高尔基体伴侣WAC(WW domain containing adaptor with coiled-coil)和GM130蛋白质，并将其从中心体运输.此外，GABARAP还能和自噬体形成的上游调控因子MAPK15、ERK8发生相互作用，从而诱导自噬的起始.(2)吞噬泡的延长、延伸阶段：GABARAP蛋白对于双膜结构的延伸是不可或缺的.GABARAP具有氨基端螺旋和由具有疏水口袋的β-链组成的C-末端，其C端甘氨酸残基被ATG4蛋白酶酶切后产生细胞质GABARAP-Ⅰ，再依次通过激活ATG7、ATG3(泛素E2样酶)和ATG12复合物，将切割的GABARAP与磷脂酰乙醇胺(Phosphatidylethanolamine，PE)缀合产生GABARAP-Ⅱ，吸附在自噬体膜上，以促进膜融合、延伸[33-34].(3)吞噬泡将底物包裹的阶段：GABARAP与ALFY(Autophagy-linked fyve protein)的结合是选择性结合，是ALFY对LC3B募集所必需的，可组装一些蛋白质到早期吞噬泡产生的位置，促进自噬前体的形成.此外，GABARAP也可通过与E3泛素连接酶相互作用调节线粒体自噬，与Dvl2(Dishevelled 2)结合，负调节Wnt通路[35-36].(4)自噬体形成与成熟阶段：GABARAP介导自噬过程中PI4KIIα(Phosphatidylinositol 4-kinase type 2 alpha)靶向调节PtdIns4P(Phosphatidylinositol-4-phosphate 3-kinase catalytic subunit type 2 alpha)依赖性自噬体-溶酶体的融合.PI4KIIα可产生磷酸肌醇4磷酸盐(PI4P)，并将GABARAPs从核周高尔基体区域结合到自噬体，若GABARAP、PI4KIIα缺失或过度表达会引起自噬流的减少，从而导致自噬体的大量积聚[37-38].此外，GABARAP蛋白可通过HOPS(Homotypic fusion and vacuole protein sorting)与PLEKHM1(Pleckstrin homology domain containing protein family member 1)一起调节自噬体-溶酶体融合.更有趣的是，GABARAPL2和GABARAP蛋白的酶促和化学脂质化形式均可促进膜融合，而LC3的脂质化形式执行类似功能的程度要比GABARAP低得多.与LC3亚家族相比，这一发现揭示了GABARAP亚家族在膜融合中的优先作用[4].

上述研究表明，自噬体的形成和成熟等过程受到GABARAP蛋白的高度调控，GABARAP在细胞定位、自噬体的形成、自噬体的运输、自噬体与溶酶体的融合、自噬通量的控制以及对雷帕霉素诱导细胞自噬等过程中均起到了关键性的作用.

3.2 调节细胞凋亡

细胞凋亡是真核细胞体内的基本稳态过程之一，在发育过程中发挥着重要作用，GABARAP家族成员不仅参与细胞的自噬过程，而且还与细胞凋亡有关.Salah等[11]用DMBA(7,12-dimethylbenz(a)anthracene)处理小鼠使之致癌，观察乳腺上皮细胞和导管的形态，发现相比于正常的小鼠，在GABARAP缺陷的小鼠体内的乳腺上皮细胞、巨噬细胞、B细胞、T细胞和导管的数量减少得更快，导管生长的长度也显著短于所有其他组小鼠.这些结果表明将GABARAP缺陷的小鼠暴露在致癌物DMBA中时，通过诱导细胞凋亡，抑制了细胞的生长，并使得细胞死亡数量显著增长.Lee等[28]发现共转染GABARAP及其互作蛋白DDX47可诱导肿瘤细胞发生凋亡.冉莉等[9]通过qPCR发现用白藜芦醇处理乳腺癌细胞，可以抑制细胞内GABARAPL1的表达并诱导细胞凋亡.

上述研究提示了GABARAP在细胞凋亡中的调节作用，但其调节机制尚有待于进一步的探讨.

3.3 在癌症和肿瘤中的功能作用

近年来，越来越多的研究表明异常自噬与多种疾病和恶性肿瘤密切相关，因此研究自噬相关基因GABARAP与肿瘤的关系对于全面认识癌症的发生发展机制有非常重要的意义.Salah等[11]发现经DMBA处理的GABARAP缺陷小鼠中，肿瘤的形成显著下降.夏燕[13]和李瑞湘[39]发现GABARAPLl在肝癌和结肠癌组织中的表达水平显著下调，并且其下调表达与乙肝病毒感染、肝炎史以及手术后生存时间有很强的关联性；同时，过表达GABARAPL1蛋白可显著抑制肝癌细胞的增殖.

上述研究为GABARAP参与体内肿瘤发生提供了有力证据，证实了GABARAP家族蛋白能够显著抑制癌细胞的无限增殖，与多种癌症的临床病理特征具有很强的关联性.因此探讨GABARAP与肿瘤的关系，对于全面认识癌症的发生发展机制以及开发特异性GABARAP抑制剂作为肿瘤靶向治疗的新型药物具有非常重大的意义.

3.4 参与免疫应答

目前，许多自噬相关基因都已经被发现在免疫反应中发挥重要作用.Salah等[11]发现用DMBA处理GABARAP缺陷的小鼠后，淋巴细胞能产生更高水平的IL-2和IFN-γ，机体也能在短时间内产生大量促炎症因子，如IL-1β和IL-6等，从而激活机体免疫系统，进行免疫应答.周智[40]分析了鳗弧菌刺激后中华绒螯蟹血淋巴细胞中EsGABARAP的时序表达情况，发现血淋巴细胞中EsGABARAP的表达水平显著上调，高达空白对照组的7倍多.白荣耀[18]检测了溶藻弧菌感染后杂色鲍血细胞和肝胰脏中SaGABARAP的相对表达水平，发现SaGABARAP基因的表达在血细胞和肝胰脏中均显著上调，但在这两个不同的组织器官中表达上调的时间和程度不同.在血细胞中，SaGABARAP基因转录水平在溶藻弧菌感染3h后最高；而在肝胰脏中，SaGABARAP的表达水平则在溶藻弧菌感染24h后达到峰值.

上述研究表明，GABARAP与免疫反应存在着密切的关系.病原或外界抗原诱导刺激，能够诱导GABARAP mRNA表达水平上调或促炎症因子的产生，参与免疫应答.

4 结论

GABARAP是一类家族同源性很高，在进化上高度保守的蛋白，在促进GABAA受体聚集和定位，以及调节细胞自噬和凋亡、参与免疫应答、抑制肿瘤和癌症等方面发挥着十分重要的作用.但目前有关GABARAP的研究主要集中在一些模式生物中，在无脊椎动物中的报道较少.对于GABARAP家族蛋白在自噬中的功能作用有较多的研究报道，但对其在细胞凋亡、免疫反应和抗肿瘤等方面的研究尚不够深入，尤其对其作用的分子机制则鲜有报道.今后，首先从广度上，相信会有更多不同进化地位生物体的GABARAP蛋白被鉴定并开展功能分析；其次，从深度上，利用CRISPR/Cas9、RNAi和免疫共沉淀等各种技术方法，有望探明GABARAP蛋白的功能作用及其详细的分子机制，为利用GABARAP蛋白开展细胞自噬、凋亡与分子免疫等基础研究，以及肿瘤等疾病的诊治提供新思路、新靶点.